一組在生理pH條件下有活力的草酸氧化酶及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一組在生理pH條件下有活力的草酸氧化酶基因及其編碼的蛋白與應(yīng) 用，尤其涉及該草酸氧化酶在用于制備降低草酸過(guò)多癥疾病病人血液或尿液中草酸濃度的 藥物中的應(yīng)用，屬基因工程技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 泌尿系結(jié)石疾病是一種全球范圍內(nèi)的重大健康疾病，絕大多數(shù)泌尿系結(jié)石由草 酸鈣或草酸鈣與磷酸鈣成分組成。許多疾病均與人體內(nèi)的草酸量過(guò)高有關(guān)，比如原發(fā)性 高草酸尿癥、第二高草酸尿癥、孤獨(dú)癥、外陰痛、草酸過(guò)多引起的晚期腎結(jié)石疾病、心臟傳 導(dǎo)障礙、克羅恩氏癥、炎癥性腸病、結(jié)腸炎、泌尿性結(jié)石、哮喘、慢性阻塞性肺病、纖維肌痛、 Zellweger綜合征等，以及其他慢性疾病。原發(fā)性高草酸尿癥（primary hyperoxaluria， PH)包括I型，II型和III型，都是極為罕見的基因突變導(dǎo)致的乙醛酸鹽代謝異常遺傳疾 病，該疾病因肝臟中特定代謝酶的缺失導(dǎo)致草酸在體內(nèi)的過(guò)度積累型疾病因乙醛酸鹽 氨基轉(zhuǎn)移酶缺失導(dǎo)致，II型疾病因乙醛酸/羥基丙酮酸還原酶缺失導(dǎo)致，III型疾病因肝臟 特有的線粒體酶4-羥基-2-氧-戊二醛縮酶缺失導(dǎo)致，還有一些非以上三種類型的原發(fā)性 高草酸尿疾病，原因正在進(jìn)一步的研宄中。原發(fā)性高草酸尿癥疾病是一種非常嚴(yán)重的遺傳 病，晚期患者體內(nèi)的血液中草酸濃度可達(dá)100 umol/L，遠(yuǎn)高于正常人草酸水平（〈5 y mol/ L)，伴隨著患者腎功能的衰竭，過(guò)飽和的草酸鈣會(huì)在腎臟、甲狀腺、心肌層、骨骼、皮膚、 血管及眼中沉積形成結(jié)石，損壞人體重要器官，危及生命。第二高草酸尿癥（secondary hyperoxaluria，SH)是一種食源性草酸吸收過(guò)度或食入大量草酸前體導(dǎo)致的疾病，原因包 括胃腸道疾病引起的，如腸炎、囊胞性纖維癥、短腸綜合征、或富含草酸食物或草酸前體飲 食偏好。第二高草酸尿癥是一種非常常見的疾病，其危害沒有原發(fā)性高草酸尿癥嚴(yán)重，但是 高血草酸及尿草酸濃度仍然會(huì)讓患者患上草酸過(guò)多引起的慢性疾病或晚期尿路系統(tǒng)衰竭。
[0003] 人體通過(guò)食源性吸收的草酸占泌尿草酸總量的10~70%不等，食物中的草酸可 以通過(guò)整個(gè)胃腸道消化系統(tǒng)吸收，包括胃，小腸和大腸，因此在消化吸收系統(tǒng)器官中去除食 物中的草酸可以有效的防止草酸被胃腸道吸收。業(yè)界公認(rèn)，草酸鈣濃度的過(guò)高會(huì)導(dǎo)致結(jié)石 的形成，因此，降低草酸的濃度有助于降低結(jié)石形成的風(fēng)險(xiǎn)。
[0004] 需要長(zhǎng)期進(jìn)行透析的慢性腎功能衰竭（CRF)和腎功能衰竭晚期（ESRF)病人也很 容易導(dǎo)致草酸過(guò)多癥。該類病人的腎功能缺失導(dǎo)致草酸無(wú)法被有效清除，同時(shí)透析過(guò)程中 需要注射維生素C作為抗氧化藥物，而其在人體內(nèi)會(huì)被代謝轉(zhuǎn)化為草酸。此類病人體內(nèi)血 液中草酸一般在30-90 y mol/L。2006年數(shù)據(jù)顯示，美國(guó)每年有34萬(wàn)人需要透析，該人數(shù)還 在一直上升，因此，該類病人也處于患草酸過(guò)多疾病的風(fēng)險(xiǎn)之中。
[0005] Zellweger綜合征（ZSD)病人也與草酸過(guò)多有很高的關(guān)聯(lián)性（83% )，ZSD是一種 過(guò)氧化物酶缺失導(dǎo)致的疾病，雖然ZSD病人草酸代謝異常的機(jī)理尚不清楚，但是ZSD病人體 內(nèi)的血草酸濃度與原發(fā)性高草酸尿癥病人是差不多的。
[0006] 迄今為止幾乎沒有有效的治療措施可以顯著的降低草酸過(guò)多癥患者形成結(jié)石的 風(fēng)險(xiǎn)，其中最主要被使用的一些方法僅僅是通過(guò)口服草酸降解酶或草酸降解細(xì)菌來(lái)限制食 物中草酸的吸收。然而，這些方法都會(huì)遇到一個(gè)共同的挑戰(zhàn)，那就是胃環(huán)境中的強(qiáng)酸性加上 高活力的胃蛋白酶會(huì)降解草酸降解酶蛋白，腸道中的胰蛋白酶和糜蛋白酶也會(huì)降解草酸降 解酶。而且，大多數(shù)已知的草酸降解酶的最適pH值均為弱酸性，所以在中性偏堿的腸道中 的無(wú)活力或活力很低?？诜菟峤到饩瑯佑龅轿傅膹?qiáng)酸環(huán)境和腸道的蛋白酶解的挑戰(zhàn)， 無(wú)法形成優(yōu)勢(shì)菌群發(fā)揮降草酸作用。
[0007] 自然界中主要有兩種草酸降解酶：草酸脫羧酶和草酸氧化酶（WWW. brenda_enzymes.org/)，然而并沒有發(fā)現(xiàn)一種草酸脫羧酶在生理環(huán)境（pH7. 4)有降解草 酸活力。第一次被明確驗(yàn)證有草酸氧化酶活力的蛋白來(lái)自于大麥，其在大麥萌發(fā)過(guò)程 中起重要作用，故又被稱為萌發(fā)蛋白（germin protein)。所有文獻(xiàn)中曾報(bào)道的萌發(fā)蛋 白類似的（germ-like)草酸氧化酶，其均在酸性條件下具有降解草酸的活力。有文章 (Biochem. J.，1962, 85, 33)報(bào)道三角梅葉片在pH7. 4條件下有草酸氧化酶活力，但是其 提取溶液沒有草酸氧化酶活力。報(bào)道的在pH>7下具有活力的草酸氧化酶，其氨基酸序 列未知，W02011/066282專利描述了一種草酸降解酶來(lái)自于真菌，其專利實(shí)施例5中的 酶并沒有被純化出來(lái)，也沒有任何序列信息，本專利發(fā)明人也曾嘗試純化該酶，但沒有成 功。Makoto K 等人也曾發(fā)表過(guò)一篇文章（Journal of the Institute of Brewing, vol 115, 2009, 232-237)，文章中說(shuō)其來(lái)自于一種大麥種子和大麥芽的草酸氧化酶在中性pH下 有活力。但是本專利發(fā)明人提取過(guò)相同種屬的大麥中的草酸氧化酶，發(fā)現(xiàn)其在PH7. 4并無(wú) 草酸氧化酶活力。因此，尋找在生理pH條件下有活力的草酸氧化酶，并獲得其氨基酸序列， 實(shí)現(xiàn)基因工程重組表達(dá)，工業(yè)化生產(chǎn)，利用其降低人體中的草酸含量的治療措施仍然是非 常必要的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，本申請(qǐng)篩選了上千種植物樣本，測(cè)試其在生理pH條 件（pH7. 4)下是否有草酸氧化酶活力，篩選到甜菜莖，香蕉皮，三角梅，夜來(lái)香，紫茉莉，守 宮木，麻風(fēng)樹等候選物種，然后通過(guò)基因克隆手段克隆到編碼草酸氧化酶的基因序列，通過(guò) 基因工程重組表達(dá)系統(tǒng)（大腸桿菌，畢赤酵母，煙草及豌豆）重組表達(dá)，驗(yàn)證基因序列的正 確性以及其草酸氧化酶的活力性質(zhì)。
[0009] 本發(fā)明提供了一組在pH 7. 4條件下有活力的草酸氧化酶，可以降解草酸或草酸 鹽，其基因序列與SEQ ID N0. 1-4中任意一項(xiàng)至少有50%的一致性。
[0010] 本發(fā)明提供了一組在pH 7. 4條件下有活力的草酸氧化酶，可以降解草酸或草酸 鹽，其基因序列與SEQ ID N0. 1-4中任意一項(xiàng)至少有55%，60%，65%，70%，75%，80%， 85%，90%，95%，98%，99%，100% 的一致性。
[0011] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一組在pH 7. 4條件下有活力的草酸氧化酶，可以降 解草酸或草酸鹽，其氨基酸序列與SEQ ID N0. 5-8中任意一項(xiàng)至少有50%的一致性。
[0012] 本發(fā)明還提供一組在pH 7. 4條件下有活力的草酸氧化酶，可以降解草酸或草酸 鹽，其氨基酸序列與SEQ ID N0. 5-8中任意一項(xiàng)有至少55%，60%，65%，70%，75%，80%， 85%，90%，95%，98%，99%，100% 的一致性。
[0013] 以上草酸氧化酶可以從甜菜莖，香蕉皮，三角梅，夜來(lái)香，紫茉莉，守宮木，麻風(fēng)樹 等植物物種中提取得到。
[0014] 本發(fā)明還提供一組在pH 7. 4條件下有活力的草酸氧化酶，可以降解草酸或草酸 鹽，是用不同分子量的聚乙二醇修飾的草酸氧化酶。
[0015]所述的聚乙二醇的分子量是 2kD, 5kD, 10kD, 20kD, 4 臂-20kD, 30kD, 40kD 或 4 臂-40kD中的任意一種。
[0016] 本發(fā)明提供一種包含草酸氧化酶基因的表達(dá)載體，其中草酸氧化酶基因序列與 SEQ IDNO.1-4中任意一項(xiàng)至少有50%的一致性。
[0017] 本發(fā)明提供一種包含草酸氧化酶基因的表達(dá)載體，其中草酸氧化酶基因序列與 SEQ IDNO.1-4 中任意一項(xiàng)至少有 55%，60%，65%，70%，75%，80%，85%，90%，95%， 98 %，99 %，100 % 的一致性。
[0018] 本發(fā)明提供一種重組表達(dá)菌種，包含以上表達(dá)載體，且能產(chǎn)生草酸氧化酶。
[0019] 本發(fā)明提供一種轉(zhuǎn)基因植物株，部分植物（包括葉片，根，花等）或植物細(xì)胞，其轉(zhuǎn) 化有含以上草酸氧化酶基因序列的表達(dá)載體。
[0020] 本發(fā)明還提供了該草酸氧化酶在制備降低草酸過(guò)多癥疾病病人草酸濃度的藥物 中的應(yīng)用。所述的草酸過(guò)多癥疾病包括原發(fā)性高草酸尿癥，二型高草酸尿癥，Zellweger癥， 或慢性泌尿系統(tǒng)損壞性疾病等。
[0021] 由于該草酸氧化酶在pH 7. 4條件下有酶活力，因此，含有草酸氧化酶的藥物可以 制成針劑或經(jīng)腸溶材料包埋。
[0022] 本發(fā)明提供的一組草酸氧化酶，它在pH7. 4條件下的比活力不低于其最大比活力 的20%，而且其是至今為止發(fā)現(xiàn)的唯一被公開的且被驗(yàn)證了的在pH7. 4或pH7. 0~8. 0有 活力的草酸氧化酶。該草酸氧化酶的發(fā)現(xiàn)為研發(fā)一種適用于治療草酸過(guò)多疾病的重組草酸 氧化酶藥物提供了可能性。本發(fā)明也可以使用草酸氧化酶制備預(yù)防草酸過(guò)多疾病的藥物。
【附圖說(shuō)明】
[0023] 圖1為畢赤酵母表達(dá)載體Z a -5102圖譜。
[0024] 圖2為畢赤酵母表達(dá)載體GAPZ a -5102圖譜。
[0025] 圖3為畢赤酵母表達(dá)載體Z a -5601圖譜。
[0026] 圖4為畢赤酵母表達(dá)載體GAPZ a -5601圖譜。
[0027] 圖5為畢赤酵母表達(dá)載體Z a -30640圖譜。
[0028] 圖6為SDS-PAGE分析畢赤酵母X33中草酸氧化酶Z a -5102的表達(dá)。
[0029] 圖7