一種新型乳糖酶的制備方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種新型乳糖酶的制備方法及其應(yīng)用，屬于基因工程領(lǐng)域。具體的說 涉及比活高、穩(wěn)定性好的新型乳糖酶的獲得，此新型乳糖酶核苷酸序列依據(jù)畢赤酵母密碼 子偏愛性的優(yōu)化，包含乳糖酶核苷酸序列的組成型表達(dá)載體及重組畢赤酵母菌株的構(gòu)建， 利用此重組酵母高密度發(fā)酵制備乳糖酶的方法，還涉及此新型乳糖酶在低乳糖牛奶制備中 的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 乳糖是由半乳糖和葡萄糖通過0-1，4-糖苷鍵連接而成的二糖。世界上約70% 的人種，尤其是亞洲人，患有"乳糖不耐受癥"，主要表現(xiàn)為腸鳴、腹瀉及腸梗塞和脹氣等。 這是由于體內(nèi)缺乏能降解乳糖的酶類，進(jìn)入腸道的乳糖就成為微生物菌群的能源，從而導(dǎo) 致形成乳酸和二氧化碳。通過口服乳糖酶或?qū)⑷樘敲柑砑又寥橹破分锌梢越鉀Q以上問 題。乳糖酶即0_半乳糖苷酶（0 _D-galactosedase, EC3. 2. 1. 23.)，是一種0半乳糖 苷半乳糖水解酶，能將乳糖水解為半乳糖和葡萄糖，此外亦具有半乳糖苷轉(zhuǎn)移作用。商品 化的乳糖酶主要用于治療乳糖不耐受癥、處理牛乳和乳清、生產(chǎn)低乳糖牛奶和低乳糖乳制 品及制備低聚半乳糖等領(lǐng)域。自然界中的乳糖酶廣泛存在于幼小哺乳動物小腸，植物如扁 桃、杏等，微生物如細(xì)菌、酵母和霉菌等。食品工業(yè)中應(yīng)用的乳糖酶主要源于克魯維氏酵母 (Kliyveromyces sp.)和曲霉屬（Aspergillus sp.)?？唆斁S氏酵母乳糖酶多為胞內(nèi)酶，最 適pH接近中性（pH6. 2~7. 0)，最適溫度35~40°C，但熱穩(wěn)定性比較差。曲霉屬乳糖酶多 為胞外酶，最適作用溫度為50°C或更高，最適pH3. 5~4.0,熱穩(wěn)定性好及作用pH低等優(yōu) 點(diǎn)，使曲霉乳糖酶在食品工業(yè)上具有更高的應(yīng)用價(jià)值。
[0003]目前乳糖酶工業(yè)化生產(chǎn)中存在的難題主要表現(xiàn)在胞內(nèi)酶提取困難和產(chǎn)量低這兩 方面。在克魯維氏酵母發(fā)酵產(chǎn)酶過程中，通過優(yōu)化發(fā)酵條件能提高產(chǎn)酶量，但是其發(fā)酵通常 以乳糖作為主要碳源和誘導(dǎo)劑，而乳糖相對其他碳源價(jià)格偏高，另外胞內(nèi)酶的存在形式也 不利于產(chǎn)品的獲取。因此，國內(nèi)外的研究均傾向于構(gòu)建基因工程菌株的方式來生產(chǎn)和制備 乳糖酶產(chǎn)品。Berka等人將來自A.oryzae CCC28的乳糖酶基因?qū)肫鋪碓淳陿?gòu)建得到 的米曲霉基因工程菌株，乳糖酶基因受GalA啟動子控制，發(fā)酵液中酶活提高至500U/ml，蛋 白表達(dá)量為lg/L。張偉等(殼白曲霉乳糖酶基因在畢赤酵母中的商效分泌表達(dá)及酶學(xué)性質(zhì) 研究，微生物學(xué)報(bào)，2005)將來自于A. candidus CGMCC3. 2919的乳糖酶基因?qū)氘叧嘟湍?GS115基因組中，利用醇氧化酶啟動子Paoxl啟動該基因的表達(dá)，發(fā)酵液中乳糖酶產(chǎn)量約為 6g/L，酶活力達(dá)3600U/ml，是目前國內(nèi)外獲得的乳糖酶的最高產(chǎn)量。但是該酶表達(dá)使用的 Paoxl啟動子屬于甲醇誘導(dǎo)型啟動子，需要在發(fā)酵過程中加入大量的甲醇，其毒性不利于食 品安全，從而限制了重組蛋白在食品工業(yè)中的應(yīng)用。
[0004] 在不同的原核、真核異源表達(dá)系統(tǒng)中，畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)具有其它表達(dá)系統(tǒng)所不 可比擬的優(yōu)點(diǎn)，除了具有甲醇誘導(dǎo)型啟動子-醇氧化酶A0X1基因啟動子用于嚴(yán)格調(diào)控外 源蛋白的表達(dá)外，還具有另一個組成型的強(qiáng)啟動子-甘油醛三磷酸脫氫酶啟動子GAP，可在 菌體生長過程中組成型表達(dá)外源蛋白。另外，外源基因隨染色體復(fù)制進(jìn)行整合型表達(dá)，穩(wěn) 定性高；菌體生長速度快，培養(yǎng)基成本低廉，易于進(jìn)行高密度發(fā)酵；易于進(jìn)行遺傳操作和培 養(yǎng)，具有真核生物的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制，如蛋白酶加工、折疊、二硫鍵的形成和糖基化，可獲得 _廣量的蛋白質(zhì)。
[0005] 綜上所述，尋求一種提取工藝簡單、高產(chǎn)且具有食品安全性的生產(chǎn)方式仍然是目 前乳糖酶研究的重要方向。本發(fā)明將高效組成型啟動子GAP與乳糖酶基因連接，構(gòu)建包含 乳糖酶的重組畢赤酵母菌株，并利用該重組酵母高密度發(fā)酵制備乳糖酶，既能解決傳統(tǒng)的 胞內(nèi)乳糖酶提取困難和產(chǎn)量低的問題，又可避免利用甲醇誘導(dǎo)畢赤酵母大規(guī)模發(fā)酵而造成 的甲醇污染和毒性隱患，有利于食品、醫(yī)藥及工業(yè)化乳糖酶的大規(guī)模生產(chǎn)與制備。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的之一在于為了改善米曲霉乳糖酶比活低、穩(wěn)定性差等缺點(diǎn)，提供一 種高活性、高熱穩(wěn)定性的新型乳糖酶，其氨基酸序列為含有序列號1的氨基酸序列。
[0007] 本發(fā)明的目的之二在于為了利于新型乳糖酶在畢赤酵母中的表達(dá)，提供一段依據(jù) 畢赤酵母密碼子偏愛性優(yōu)化得到的乳糖酶核苷酸序列，此核苷酸序列為含有序列號2的核 苷酸序列。
[0008] 本發(fā)明的目的之三在于為了解決乳糖酶生產(chǎn)中的胞內(nèi)酶提取困難的問題，提供一 種用于分泌制備新型乳糖酶的重組畢赤酵母菌株。
[0009] 本發(fā)明的目的之四在于為了提高乳糖酶的工業(yè)化產(chǎn)量，提供一種用于制備乳糖酶 的重組酵母高密度發(fā)酵方法。
[0010] 本發(fā)明的目的之五在于為了滿足乳糖酶在食品中的應(yīng)用，而提供一種低乳糖牛奶 的制備工藝。
[0011] 本發(fā)明的上述目的通過以下技術(shù)方案達(dá)到：首先構(gòu)建米曲霉乳糖酶成熟肽編碼序 列隨機(jī)突變體庫，并篩選比活高、穩(wěn)定性好的酶蛋白突變體，測序確定突變位點(diǎn)，然后將突 變序列按照畢赤酵母密碼子偏愛性進(jìn)行優(yōu)化，構(gòu)建用于表達(dá)乳糖酶的組成型表達(dá)載體，及 用于制備乳糖酶的重組畢赤酵母菌株，利用該重組酵母的高密度發(fā)酵制備此新型乳糖酶。 最后利用此新型乳糖酶水解牛奶中的乳糖，確定制備低乳糖牛奶的方法。
[0012] 本發(fā)明采用易錯PCR方法構(gòu)建序列號3所示米曲霉乳糖酶成熟肽編碼序列隨機(jī)突 變體庫，利用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)突變體蛋白，從中篩選比活高、穩(wěn)定性好的突變株，測 序確定突變位點(diǎn)，對應(yīng)的氨基酸突變?yōu)椋?31位絲氨酸突變?yōu)楦拾彼幔?01位異亮氨酸突變 為甲硫氨酸，970位天冬酰胺突變?yōu)樘於彼帷?br>[0013] 本發(fā)明將序列號3所示的核苷酸序列進(jìn)行相應(yīng)突變后按照畢赤酵母密碼子偏愛 性優(yōu)化得到含有序列號2的核苷酸序列。
[0014] 將含有序列號2的核苷酸序列與組成型質(zhì)粒pGAPZaA進(jìn)行可操作性連接，將該 序列連入組成型啟動子GAP下游，構(gòu)建得到包含乳糖酶基因序列的重組表達(dá)載體，命名為 pGAPZaA-lac。
[0015] 本發(fā)明采用電穿孔的方法將包含乳糖酶核苷酸序列的組成型表達(dá)載體 pGAPZaA-lac整合入畢赤酵母SMD1168H菌株的基因組上，利用抗生素篩選得到包含乳糖 酶基因的重組畢赤酵母菌株。所得重組畢赤酵母菌株命名為畢赤酵母（Pichia pastoris) SMD1168H-pGAPZaA-lac，已于2013年10月17日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通 微生物中心(地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編 100101)保藏，分類命名為畢赤酵母（Pichia pastoris)，保藏號CGMCC No. 8349。
[0016] 本發(fā)明利用上述重組酵母制備乳糖酶的高密度發(fā)酵工藝包括：將重組酵母接種培 養(yǎng)，然后按5%~10%的接種量接入含3%~6%葡萄糖的發(fā)酵基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中；通氣攪拌培 養(yǎng)，并在整個發(fā)酵過程中氧飽和度不低于20% ;培養(yǎng)15~18h至葡萄糖完全耗盡后，按照 12~18mV (h?L)的流量流加40%~80%葡萄糖：10%~50%甘油：0? 05%~0? 3%磷酸氫 二銨=1~4:1~4:0. 005~0. 05的混合溶液，繼續(xù)培養(yǎng)30h以上。
[0017] 本發(fā)明采用新型乳糖酶制備低乳糖牛奶的方法包括：按l〇U/ml牛奶的添加量 60°C水解24h，或37°C水解48h;按30U/ml牛奶的添加量，25°C水解48h，或KTC水解108h。
[0018] 本發(fā)明由米曲霉乳糖酶改造得到的新型乳糖酶具有如下優(yōu)點(diǎn)：
[0019] (1)新型乳糖酶比活由480U/mg提高至700U/mg，pH作用范圍由4~7增寬至3~ 7;最適作用溫度由55°C提高至60°C ;60°C保溫30min由完全失活提高到殘余酶活75%，更 適于乳品行業(yè)的應(yīng)用；
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