一種中性內(nèi)切葡聚糖酶及其編碼基因與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種中性內(nèi)切葡聚糖酶及其編碼基因與應(yīng) 用。
【背景技術(shù)】
[0002] 纖維素是植物纖維的主要成分，約占其干重的30~50%，是目前分布最廣的天然 碳水化合物，也是地球上最豐富、最廉價(jià)的可再生資源。隨著世界人口的激增、全球經(jīng)濟(jì)的 飛速發(fā)展、糧食的短缺和石油、煤炭和天然氣等不可再生資源正以驚人的速度減少，可再生 纖維素資源的開發(fā)利用已引起全世界的普遍關(guān)注，成為世界各國研究的重大課題。纖維素 酶的研究為此開辟了一條廣闊的途徑，特別是近10年來，隨著現(xiàn)代生物技術(shù)迅速發(fā)展，基 因重組技術(shù)及其一系列分子生物學(xué)技術(shù)的應(yīng)用，使這一領(lǐng)域的研究更為深入，并在應(yīng)用上 將顯示出其潛在的價(jià)值。
[0003] 纖維素酶（cellulase)是降解天然纖維素生成纖維素分子鏈、纖維二糖和葡萄糖 的一組酶的總稱。所以，纖維素酶不是單一成分的酶，而是一組酶系的總稱。目前根據(jù)其催 化功能的不同，普遍認(rèn)為纖維素酶可分為由三類不同水解功能的酶組成：內(nèi)切葡聚糖酶，外 切葡聚糖酶，葡萄糖苷酶。
[0004] I、內(nèi)切型葡萄糖苷酶（endo-l, 4_ P-D glucanase，EC3. 2. 1. 4,簡稱 EBG)，也稱 Cx 酶、CMC酶、EG。這類酶作用于纖維素分子內(nèi)部的非結(jié)晶區(qū)，隨機(jī)識別并水解0-1，4-糖苷 鍵，將長鏈纖維素分子截短，產(chǎn)生大量非還原性術(shù)端的小分子纖維素；
[0005] II、外切型葡萄糖苷酶（exo-1, 4-6-D glucanase，EC3. 2. 1. 91)，也稱 C1 酶、微品 纖維素酶、纖維二糖水解酶（cellobiohydrolase，簡稱CBH)，這類酶從纖維長鏈的非還原 性末端水解3 -1，4-糖苷鍵，每次切下一個(gè)纖維二糖分子；
[0006] III、葡萄糖苷酶（P-glucosidase，EC3. 2. 1. 21，簡稱BG)又稱纖維二糖酶，它 能水解纖維二糖以及短鏈的纖維寡糖生成葡萄糖，對纖維二糖和纖維三糖的水解很快，隨 著葡萄糖聚合度的增加水解速度下降，這種酶的專一性比較差。
[0007] 纖維素的降解必須依靠三種組分的協(xié)同作用才能完成。外切0 -葡聚糖苷酶從纖 維索的非還原多聚體末端水解1，4- 0 -糖苷鍵，將天然纖維素分解為直鏈纖維素，使其轉(zhuǎn) 變成水合非結(jié)晶纖維素；內(nèi)切3 _葡聚糖苷酶則水解纖維素的內(nèi)在糖苷鍵，將直鏈纖維素 內(nèi)部切斷，分解為纖維二糖和纖維寡糖；而葡萄糖苷酶則將纖維二糖分解成兩個(gè)葡萄 糖單位。
[0008] 內(nèi)切葡聚糖酶可以分為三種類型：酸性內(nèi)切葡聚糖酶（最適pH3~5)、中性內(nèi)切 葡聚糖酶（最適pH6~8)和堿性內(nèi)切葡聚糖酶（最適pH8~10)。酸性纖維素酶主要用于 棉及其混紡織物的生物拋光整理上。而中性纖維素酶主要用于牛仔布及其服裝的洗舊石磨 處理上。堿性纖維素酶主要家用洗滌劑中，可增強(qiáng)洗滌劑的去污能力，經(jīng)常使用還可改善織 物的表面特性。
[0009] 酸性內(nèi)切葡聚糖酶主要由絲狀真菌產(chǎn)生，其產(chǎn)生菌主要包括里氏木霉、康寧木霉、 黑曲霉等。酸性內(nèi)切葡聚糖酶研究再早，但隨著工業(yè)應(yīng)用范圍的不斷擴(kuò)展和應(yīng)用研究的不 斷深入，酸性葡聚糖酶也顯現(xiàn)出諸多不足。如中堿性條件下酶活性較低或根本沒有活性、穩(wěn) 定性差、pH值食用范圍窄，而且在酸性條件下處理紡織品后會(huì)產(chǎn)生褪色現(xiàn)象等，這極大限制 了內(nèi)切葡聚糖酶在堿性洗滌劑、紡織品酶洗整理等工業(yè)中的應(yīng)用。因此，尋找新型、高效、穩(wěn) 定和pH值適應(yīng)范圍更廣的內(nèi)切葡聚糖酶意義重大。
[0010] 由細(xì)菌產(chǎn)生的內(nèi)切葡聚糖酶主要是中性和堿性內(nèi)切葡聚糖酶，在中性和堿性條件 下均具有一定的酶活性及穩(wěn)定性。與真菌產(chǎn)生的酸性內(nèi)切葡聚糖酶相比，由細(xì)菌產(chǎn)生的 中性和堿性內(nèi)切葡聚糖酶具有其共同而獨(dú)特的優(yōu)越性：（l)pH值適應(yīng)范圍廣，一般在pH值 6-10之間均具有較高的酶活性；（2)穩(wěn)定性好，可以耐受60°C的高溫；（3)酶成分單一，主 要酶活性成分為內(nèi)切葡聚糖酶，便于工業(yè)應(yīng)用；(4)可用細(xì)菌發(fā)酵生產(chǎn)，發(fā)酵周期短；（5)可 以承受很高的pH值，作為洗滌用酶可使衣物經(jīng)過多次洗滌后手感、外觀等保持鮮艷；(6)可 以在中性環(huán)境中處理紡織品，不會(huì)造成紡織品褪色等。可見，對于條件要求甚高的洗滌和紡 織工業(yè)用酶，細(xì)菌產(chǎn)中性纖維素酶有比傳統(tǒng)酸性纖維素酶更好的優(yōu)越性。因此，尋找新的具 有優(yōu)良性質(zhì)的中性纖維素酶對我國造紙工業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，本發(fā)明的首要目的在于提供一種中性內(nèi)切葡聚 糖酶H31基因的核苷酸序列及其氨基酸序列。本發(fā)明根據(jù)內(nèi)切葡聚糖酶保守序列設(shè)計(jì)簡并 引物，用PCR的方法成功克隆出中性內(nèi)切葡聚糖酶基因。
[0012] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種含有上述含信號肽編碼序列的H31基因的表達(dá) 載體。
[0013] 本發(fā)明的另一目的在于提供含有上述含信號肽編碼序列的H31基因的大腸桿菌 菌株。
[0014] 本發(fā)明的再一目的在于提供上述重組堿性木聚糖酶H31的應(yīng)用。
[0015] 本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：一種中性內(nèi)切葡聚糖酶H31基因，所述的 H31基因的核苷酸序列如SEQ ID No :1所示：
[0016] ATGCTCCTCGCCGCCGCCACTCCCGCCCGGGCGGACACCACGATCTGCGAGCCCTTCGGGTCGACC GTGATCCAGGGCCGCTACGTCGTCCAGAACAACCGCTGGGGCACCGGCGCCCCCCAGTGCGTCACCGCGACGGA CACCGGCTTCCGGGTCATCCAGGCCGACGGCTCGGTGCCCACCGACGGCGCTCCCAAGTCGTACCCGTCGGTCTT CAACGGCTGCCACTACACCAACTGTTCGCCCGGGACCAGGCTCCCCGCACGGATCAGCACCATCTCCAGCGCGCC CAGCAGCATCTCCTACGGCTACGTGCCGGGCGGTGTGTACAACGCCGCGTACGACATCTGGCTGGACCCGACGCC CCGCACCGACGGTGTCAACCGGACCGAGATCATGATCTGGTTCAACCGGGTCGGCCCGGTCCAGCCGATCGGCTC TCCGGTCGCCACCGCAACCGTCGGTGGGCGCACCTGGGAGGTGTGGACGGGCAGCAACGGCACCAACGACGTGAT CTCCTTCGTCGCCCCGTCGACCATCACGAGCTGGAGCTTCGACGTCATGGACTTCGTCGACCAGGCCGTCAACCG GGGCCTGGCGCAGCGCGACTGGTACCTGACGAGCGTTCAGGCCGGCTTCGAACCGTGGCGGGACGGCGTCGGACT GGCGGTGCACTCCTTCTCCTCCACCGTGAACGTCGGCGGTGACCCCGGCGGGCCGGGCGGGCCGGGTGCCCCGGC GCCCGCCTGCCAGGTGGTGTAG。
[0017] 所述中性內(nèi)切葡聚糖酶H31基因序列為一個(gè)完整的開放閱讀框（0RF)，該開放閱 讀框以起始密碼子ATG開始而以終止密碼子TAG結(jié)束，共包括762個(gè)核苷酸。其中，前33 個(gè)核苷酸為信號肽編碼序列（ATGCTCCTCGCCGCCGCCACTCCCGCCCGGGCG)。
[0018] 上述中性內(nèi)切葡聚糖酶H31基因編碼的蛋白質(zhì)，其氨基酸序列如SEQIDNo :2所 示：
[0019] MLLAAATPARADTTICEPFGSTVIQGRYVVQNNRffGTGAPQCVTATDTGFRVIQADGSVPTDGAPKSYP SVFNGCHYTNCSPGTRLPARISTISSAPSSISYGYVPGGVYNAAYDIffLDPTPRTDGVNRTEIMIffFNRVGPVQPIG SPVATATVGGRTffEVffTGSNGTNDVISFVAPSTITSffSFDVMDFVDQAVNRGLAQRDffYLTSVQAGFEPffRDGVGLA VHSFSSTVNVGGDPGGPGGPGAPAPACQVV-o
[0020] 中性內(nèi)切葡聚糖酶H31基因開放閱讀框編碼253個(gè)氨基酸，其中，MLLAAATPARA (前 11個(gè)氨基酸）為基因編碼的信號肽，其在成熟酶蛋白分泌時(shí)在Ala11位點(diǎn)被切除。因此，成 熟的酶蛋白從第十二個(gè)氨基酸（Asp 12)開始（用下劃線表示），共計(jì)242個(gè)氨基酸，其理論 分子量（MWt)為25. 51kD，酶蛋白的理論等電點(diǎn)（pi)為4. 84。
[0021] 一種含有上述中性內(nèi)切葡聚糖酶H31基因的表達(dá)載體。
[0022] 所述的表達(dá)載體為適于在大腸桿菌中表達(dá)的載體。
[0023] 本發(fā)明的中性內(nèi)切葡聚糖酶H31基因被插入至pET_28a(+)載體中。
[0024] 本發(fā)明的中性內(nèi)切葡聚糖酶H31基因被插入至pET_28a(+)載體中的EcoR I和 Hind III酶切位點(diǎn)之間；
[0025] 含有本發(fā)明的中性內(nèi)切葡聚糖酶H31基因的大腸桿菌菌株。
[0026] 所述的大腸桿菌菌株含有本發(fā)明的表達(dá)載體。
[0027] -株表達(dá)中性內(nèi)切葡聚糖酶H31的菌株，是將上述中性內(nèi)切葡聚糖酶H31基因序 列構(gòu)建成載體后轉(zhuǎn)染到大腸桿菌（Escherichia coli，E.coli)BL21 Star(DE3)得到。
[0028] -株表達(dá)中性內(nèi)切葡聚糖酶H31的菌株的制備方法，包括如下步驟：
[0029]用PCR方法從Str印tomyces sp.H31(CCTCC No :M 2015003)的基因組DNA中克 隆出上述中性內(nèi)切葡聚糖酶H31基因的酶基因全長，將其插入到原核表達(dá)載體pET-28a(+) 中，得到重組質(zhì)粒pET-28a-H31，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌E. coli BL21 Star(DE3)菌株；經(jīng)過篩選 后得到表達(dá)所述的中性內(nèi)切葡聚糖酶H31的菌株E. coli BL21 Star(DE3)-H31;
[0030] 所述的PCR的所用的引物的序列：
[0031]上游引物#-CCGGAATTCATGCTCCTCGCCGCCGCCACTC~3,;(下劃線的序列表示的 是EcoR I酶切位點(diǎn)）
[0032]下游引物：5 ^-CCCAAGCTTCTACACCACCTGGCAGGCGGGCG-3^ ;(下劃線的序列表示 的是Hind III酶切位點(diǎn)）
[0033] 所述的PCR的反應(yīng)體系為：
[0034]使用Takara的 PCRAmplification Kit試劑盒，以Streptomyces sp.H31 的基因 組DNA為模板，按照如下反應(yīng)體系配制PCR反應(yīng)液：
[0035]ddH20 17.25ii L ;10XLA PCR Buffer II2. 5ii L ;dNTP Mixture2ii L ;上游引物 〇?5ii L ;下游引物0?5ii L ;模板 2ii L ;LA Taq酶0?25ii L ;Total25ii L/Sample(樣品）。
[0036]所述的 PCR 的反應(yīng)條件為：94°C 5min ;94°C 30s, 55°C 30s，72°C 60s，30 個(gè) Cycles; 72°C 7min ;25°C 保持。
[0037] 所述的中性內(nèi)切葡聚糖酶H31在洗滌及造紙等工業(yè)中的應(yīng)用。
[0038] 本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)，具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果：
[0039] 根據(jù)酶基因序列BLAST分析結(jié)果結(jié)合酶蛋白在分子量、等電點(diǎn)及酶學(xué)特性等方面 與己知蛋白的差異判斷，中性內(nèi)切葡聚糖酶基因?yàn)橐恍掳l(fā)現(xiàn)的內(nèi)切0 -1，4-內(nèi)切葡聚糖酶