一種酶解修飾的銅藻多糖及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種酶解修飾的銅藻多糖及其在制備抗氧化劑、吸濕劑和保濕劑中的 應(yīng)用。 (二）
【背景技術(shù)】
[0002] 多糖（polysaccharide)是一類結(jié)構(gòu)及其復(fù)雜、分子量巨大的碳水化合物，通常由 多個單糖經(jīng)脫水、縮合而形成。自然界中的多糖類化合物廣泛地分布于生物體內(nèi)中，是生命 有機(jī)體的重要組成成分。海藻多糖結(jié)構(gòu)復(fù)雜，生物活性顯著且多樣：其抗氧化、抗衰老的作 用，是利用了海藻多糖能夠抑制自由基的活性；促進(jìn)免疫、抗腫瘤的作用，主要是通過提高 巨噬細(xì)胞的吞噬能力來實(shí)現(xiàn)；降血糖、降血脂的作用，是利用了多糖的吸附性；而抗凝血作 用，是因?yàn)楹Ｔ宥嗵谴蟛糠质橇蛩狨ザ嗵?，它抗凝血作用機(jī)理同肝素作用機(jī)理相似。另外海 藻多糖還具有很好的吸濕保濕性和美白抗輻射作用。
[0003] 據(jù)《中華海洋本草》記載，自古以來銅藻作為中藥"海菌"使用。其性咸、味寒，歸 肝、胃、腎經(jīng)，有消痰軟堅、清熱利水的功效，可以又來治療水腫或腳氣浮腫、甲狀腺腫、頸淋 巴結(jié)腫、癭瘤、瘰痛、等疾病?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》中對其也有記錄，如："主癭瘤氣，頸下核，破散 結(jié)氣，癰腫，瘕堅氣腹中上下鳴，下十二水腫"。通過野外實(shí)地調(diào)查和民間訪問考察發(fā)現(xiàn)，我 國廣東、海南沿海等地的居民多將其作為"海藻"藥材全藻入藥使用，是一種重要的海藻資 源。但目前的研宄表明天然銅藻多糖的結(jié)構(gòu)并不均一、活性基團(tuán)含量相對有限。通過有目 的地修飾多糖能有效提高多糖的溶解性和生物活性。
[0004] 生物酶法修飾多糖主要指酶法降解多糖，是利用專一性酶或非專一性酶對多糖進(jìn) 行生物降解而得到低分子量多糖或寡糖的一種降解手段。由于化學(xué)和物理降解方法存在反 應(yīng)條件不易控制、降解產(chǎn)物分子量分布寬、不均一等、副產(chǎn)物多缺點(diǎn)，因此很難應(yīng)用到工業(yè) 生產(chǎn)中。而酶降解法可特異性地、選擇性地切斷糖苷鍵，得到均一降解產(chǎn)物，并且在反應(yīng)過 程中底物的有效功能基團(tuán)和寡糖的自身結(jié)構(gòu)不會遭到破壞，因此產(chǎn)物的活性較高。另外與 化學(xué)降解相比，酶降解反應(yīng)條件溫和、易控制，不需要加入大量的化學(xué)試劑，減少對環(huán)境的 污染，并且降解速度快，是一種較為理想的降解方法。 (三）

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明目的是針對上述天然銅藻多糖存在的問題，提供一種分子片段均一、抗氧 化性和吸濕保濕性能明顯提高的酶解修飾的銅藻多糖以及該多糖在制備抗氧化劑、吸濕劑 和保濕劑中的應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：
[0007] 本發(fā)明提供了一種酶解修飾的銅藻多糖，其制備方法包括：
[0008] (1)銅藻多糖微波提?。恒~藻粉末用95%乙醇進(jìn)行微波提取，提取結(jié)束后經(jīng)冷凍 離心分離得到多糖粗提液；
[0009] (2)分級醇沉：取多糖粗提液，在最終乙醇體積分?jǐn)?shù)為30~40%的條件下進(jìn)行沉 淀操作，冷凍離心得到沉淀a和上清液a ;
[0010] 取上清液a在最終乙醇體積分?jǐn)?shù)為55~65%的條件下進(jìn)行沉淀操作，沉淀完全后 經(jīng)冷凍離心得到沉淀b和上清液b，沉淀b經(jīng)水溶、蒸發(fā)、冷凍干燥得到SHP60粗多糖組分； [0011] (3) SHP60粗多糖組分經(jīng)脫色、脫蛋白得到SHPA多糖；
[0012] (4)在pH4. 5~5. 5的HAc-NaAc緩沖液體系中，SHPA多糖和葡聚糖酶于45~55°C 進(jìn)行酶解反應(yīng)〇. 5~4h，終止反應(yīng)后酶解反應(yīng)液采用孔徑大小為500Da規(guī)格的透析袋進(jìn)行 流水透析，透析液經(jīng)濃縮、冷凍干燥得到酶解產(chǎn)物；
[0013] (5)酶解產(chǎn)物配成水溶液用0. 45 ym微濾膜過濾，所得濾液用DEAE-Sepharose Fast Flow離子柱層析系統(tǒng)進(jìn)行離子柱層析，分別以蒸餾水、0. 1~0. 4mol/L NaCl水溶液 進(jìn)行洗脫，選定最大洗脫峰對應(yīng)的洗脫液，濃縮、用〇.45 ym微濾膜過濾得到濾液；
[0014] (6)步驟（5)所得濾液用S印hadex G-25凝膠層析系統(tǒng)進(jìn)行凝膠柱層析，以蒸餾水 進(jìn)行洗脫，以硝酸銀指示劑檢測洗脫液中是否脫鹽完全并收集不含鹽的多糖部分，濃縮，冷 凍干燥得到酶解修飾的銅藻多糖。
[0015] 本發(fā)明中，銅藻粉末在微波提取之前可先用95%乙醇浸泡脫脂。
[0016] 所述步驟⑴中，95%乙醇的加入體積以銅藻粉末的質(zhì)量計為10~20mL/g，微波 處理?xiàng)l件優(yōu)選為：微波功率400~600W，溫度為50~90°C，微波時間為10~30min。
[0017] 所述步驟（2)中，取多糖粗提液，優(yōu)選在最終乙醇體積分?jǐn)?shù)為30%的條件下進(jìn)行 沉淀操作，得到冷凍離心得到沉淀a和上清液a。
[0018] 所述步驟（2)中，取上清液a，優(yōu)選在最終乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%的條件下進(jìn)行沉淀 操作，沉淀完全后經(jīng)冷凍離心得到沉淀b和上清液b。
[0019] 所述步驟（3)中，SHP60粗多糖組分的脫色、脫蛋白可采用常規(guī)的多糖脫色、脫蛋 白操作，例如采用大孔樹脂脫色，Sevage試劑脫蛋白，其中大孔樹脂可使用國產(chǎn)大孔樹脂 1180、DM130、或 SD300。
[0020] 進(jìn)一步，本發(fā)明具體推薦的脫色方法為：取SHP60粗多糖組分溶于蒸餾水配成多 糖溶液，加入大孔樹脂混勻，攪拌脫色8~16h，取混合液真空抽濾得到脫色樣品液。
[0021] 進(jìn)一步，本發(fā)明具體推薦的脫蛋白方法為：取脫色樣品液與Sevage試劑混勻（優(yōu) 選混合體積比為3~6:1)，充分?jǐn)嚢瑁▋?yōu)選攪拌時間20~40min)后冷凍離心，取上清液， 沉淀重復(fù)上述操作多次（優(yōu)選3~6次），所得上清液經(jīng)濃縮、冷凍干燥得SHPA多糖。
[0022] 所述步驟（4)中，SHPA多糖與葡聚糖酶的投料質(zhì)量比為1 :0. 5~2,優(yōu)選為1:1~ 2,所述葡聚糖酶在所述緩沖液體系中的質(zhì)量濃度為0. 3-0. 4%。
[0023] 所述步驟⑷中，酶解時間優(yōu)選為1~3小時，更優(yōu)選2小時。
[0024] 所述步驟（5)中，離子柱層析中，上樣流速優(yōu)選為1~2mL/min，洗脫流速優(yōu)選為 2 ~4mL/min〇
[0025] 所述步驟（6)中，凝膠柱層析中，上樣流速為1~3mL/min，洗脫流速為2~4mL/ min〇
[0026] 本發(fā)明中，冷凍離心在轉(zhuǎn)速8000~lOOOOrpm、溫度4~15°C條件下進(jìn)行，離心時 間優(yōu)選5~15min〇
[0027] 本發(fā)明提供了所述酶解修飾的銅藻多糖在制備抗氧化劑中的應(yīng)用。
[0028] 本發(fā)明還提供了所述酶解修飾的銅藻多糖在制備吸濕劑中的應(yīng)用。
[0029] 本發(fā)明還提供了所述酶解修飾的銅藻多糖在制備保濕劑中的應(yīng)用。
[0030] 本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在：
[0031] (1)本發(fā)明中微波提取的應(yīng)用能夠降低提取溫度，縮短提取時間，避免了長時間高 溫加熱對銅藻多糖生物活性的破壞，同時微波作用能夠有效破碎銅藻細(xì)胞壁釋放多糖，提 高多糖的提取率，并且一定程度上降低多糖的分子量。另外微波法提取銅藻多糖節(jié)能減耗， 作用均勻，適合放大規(guī)?；a(chǎn)。
[0032] (2)本發(fā)明對銅藻粗多糖進(jìn)行分級醇沉，能夠有效提高多糖的純度和控制分子量 分布。通過分級醇沉，粗多糖的總糖含量達(dá)到50%以上，分子量分布為986. 3~1790. 8KDa。
[0033] (3)本發(fā)明對銅藻多糖SHPA進(jìn)行不同程度酶解、透析、層析柱純化，實(shí)現(xiàn)銅藻多糖 分子量的可控降解，體外抗氧化試驗(yàn)、保濕試驗(yàn)、吸濕試驗(yàn)結(jié)果證明通過酶解可有效提高多 糖的抗氧化性、保濕性和吸濕性。
[0034] 綜上，本發(fā)明方法充分利用豐富的銅藻海洋資源，通過微波提取，提高多糖提取 率，并且通過酶法修飾改善其抗氧化活性和保濕性；同時實(shí)現(xiàn)分子量可控降解，分子量分布 均一，條件溫和，節(jié)能減耗，可規(guī)模化、機(jī)械化生產(chǎn)，操作簡單高效。 (四）【具體實(shí)施方式】
[0035] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于 此：
[0036] 實(shí)施例1 :
[0037] (1)銅藻多糖微波提取：將銅藻洗凈，控水，置于烘箱內(nèi)60°C烘干，粉碎。取藻粉加 95%乙醇溶液浸泡脫脂，靜置過夜。取200g銅藻粉末，料液比為1:20,微波時間為20min， 微波功率500W，溫度為65°C，進(jìn)行微波提取。提取結(jié)束冷卻靜置lh，冷凍離心10min (轉(zhuǎn) 速lOOOOrpm，溫度4°C )。取上清液即多糖粗提液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至1~3L，加入95 %乙醇 溶液至最終乙醇體積分?jǐn)?shù)為30 %，靜置過夜。樣液冷凍離心10min (轉(zhuǎn)速810000rpm，溫度 4°C )，取沉淀，加入少量蒸餾水將沉淀完全溶解，減壓蒸發(fā)并將殘留酒精完全蒸發(fā)，并濃縮 至20mL，經(jīng)冷凍干燥得SHP30粗多糖組分。上清液逐級加入95%乙醇溶液，重復(fù)上述操作， 分別得SHP60和SHP80兩個粗多糖組分。
[0038] (2)SHP60脫色、脫蛋白：取SHP60溶于蒸餾水配成2%多糖溶液，加入大孔樹脂 500g，混勻。于磁力攪拌器攪拌