一種y染色體微缺失快速基因檢測的擴(kuò)增組合物、含有該擴(kuò)增組合物的試劑盒及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于細(xì)胞分子遺傳學(xué)領(lǐng)域，涉及一種Y染色體微缺失快速基因檢測的擴(kuò)增組合物、含有該擴(kuò)增組合物的試劑盒及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]Y染色體微缺失是男性無精或重度少弱精的重要原因。在精子發(fā)生障礙引起男性不育的患者中，Y染色體微缺失的發(fā)生率是居于第二遺傳因素，僅次于克氏綜合癥?；赮染色體微缺失檢測的重要性，歐洲男科學(xué)會(huì)和歐洲分子遺傳質(zhì)量網(wǎng)聯(lián)合推出了 Y染色體微缺失檢驗(yàn)指南，使其成為一項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)化的檢查項(xiàng)目。目前男科學(xué)要求Y染色體微缺失基因檢測作為男性不育的常規(guī)檢查，一方面可以為不明病因的男性不育患者找出病因，另一方面為男性不育患者臨床診斷提供依據(jù)和指導(dǎo)。
[0003]1976年Ti印olo等在1170例男性不育患者中發(fā)現(xiàn)6例無精子患者在顯微鏡下發(fā)現(xiàn)長臂缺失，推測在Y染色體長臂上存在精子生成基因，將其稱為無精子區(qū)(azoospermiafactor reg1n AZF)。在此基礎(chǔ)上，1996 年 Vogt 將 AZF 進(jìn)一步劃分為 AZFa、AZFb 和 AZFc三個(gè)亞區(qū)。AZF區(qū)的缺失或突變可能引起少精子癥或無精子癥。
[0004]2004年，歐洲男科學(xué)會(huì)和歐洲分子遺傳質(zhì)量網(wǎng)聯(lián)合推出的Y染色體微缺失檢驗(yàn)指南中，推薦在每個(gè)AZF區(qū)域使用2個(gè)序列標(biāo)簽位點(diǎn):SY84 (AZFa)、SY86 (AZFa)、SY127 (AZFb)、SYl34 (AZFb)、SY254 (AZFc)、SY255 (AZFc)，這6個(gè)序列標(biāo)簽位點(diǎn)能檢出超過95%的AZF缺失。由于指南嚴(yán)格、規(guī)范、高度可重復(fù)性，是目前國際上普遍遵循的Y染色體微缺失檢測方法。該檢驗(yàn)方法抽提外周血DNA，通過5對引物進(jìn)行多重PCR反應(yīng)。最后通過電泳檢測是否存在男性Y染色體的微缺失。
[0005]長期以來，必須采用DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增幾乎是PCR技術(shù)的“鐵律”。為有效對各種“自然樣品”進(jìn)行擴(kuò)增，一些世界知名生物技術(shù)公司如Quiagen，Promega等競相發(fā)展高效力的DNA抽提技術(shù)，以將抽提的尚品質(zhì)的DNA用于下游PCR反應(yīng)。然而，進(jìn)彳丁 DNA抽提自身有一定缺點(diǎn)。包括:(I)抽提過程中存在耗損。無論多么高效的DNA抽提技術(shù)，都不可能將樣品中的DNA無耗損抽提處理。特別在微量樣品抽提時(shí)更是如此。(2)操作費(fèi)事費(fèi)力。即便是最快捷的DNA抽提，通常耗時(shí)也在45分鐘到I小時(shí)左右。在樣本量較大時(shí)，抽提DNA會(huì)占據(jù)實(shí)驗(yàn)人員相當(dāng)多的時(shí)間和精力。(3)增加經(jīng)濟(jì)支出，越是高效的DNA抽提試劑越是昂貴。抽提DNA所占據(jù)的成本甚至遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于PCR反應(yīng)自身。(4)即使進(jìn)行DNA抽提，在少部分特殊的樣品里，也很難去除PCR反應(yīng)抑制物。
[0006]中國專利200710074317.X公開了男性Y染色體微缺失檢測試劑盒及檢測方法，200910094618.8公開了一種Y染色體微缺失的基因檢測方法，均采用的是從外周血中提取DNA利用多重PCR擴(kuò)增的方法，操作費(fèi)時(shí)費(fèi)力，增加經(jīng)濟(jì)支出。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明提供一種可快速、穩(wěn)定、高效并且直接對全血一次性擴(kuò)增多個(gè)基因片段的Y染色體微缺失快速基因檢測的擴(kuò)增組合物。
[0008]本發(fā)明還提供一種含有該擴(kuò)增組合物的試劑盒。
[0009]本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是:
[0010]一種Y染色體微缺失快速基因檢測的擴(kuò)增組合物，該擴(kuò)增組合物包括AB兩組，每組包含AZFa、AZFb、AZFc區(qū)域各一對引物和兩對內(nèi)對照引物ZFY和SRY，每組內(nèi)的引物組合如下:
[0011]A組:
[0012]內(nèi)對照ZFY引物對，其具有如SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列；
[0013]ZFY-F:5’ -ACC RCT GTA CTG ACT GTG ATT ACA C -3’
[0014]ZFY-R:5，-GCA CYT CTT TGG TAT CYG AGA AAG T -3，
[0015]內(nèi)對照SRY引物對，其具有如SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4所示的核苷酸序列；
[0016]SRY-F:5’ -GAA TAT TCC CGC TCT CCG GA -3’
[0017]SRY-R:5’ -GCT GGT GCT CCA TTC TTG AG -3’
[0018]SY254位點(diǎn)引物對，其具有如SEQ ID N0.5和SEQ ID N0.6所示的核苷酸序列；
[0019]SY254-F:5’ -GGG TGT TAC CAG AAG GCA AA -3’
[0020]SY254-R:5’ -GAA CCG TAT CTA CCA AAG CAG C -3’
[0021]SY86位點(diǎn)引物對，其具有如SEQ ID N0.7和SEQ ID N0.8所示的核苷酸序列；
[0022]SY86-F:5’ -GTG ACA CAC AGA CTA TGC TTC -3’
[0023]SY86-R:5，-ACA CAC AGA GGG ACA ACC CT -3，
[0024]SY127位點(diǎn)引物對，其具有如SEQ ID N0.9和SEQ ID N0.10所示的核苷酸序列；
[0025]SY127-F:5’ -GGC TCA CAA ACG AAA AGA AA -3’
[0026]SY127-R:5’ -CTG CAG GCA GTA ATA AGG GA -3’
[0027]B組:內(nèi)對照ZFY引物對，其具有如SEQ ID N0.11和SEQ ID N0.12所示的核苷酸序列；
[0028]ZFY-F:5，-ACC RCT GTA CTG ACT GTG ATT ACA C -3，
[0029]ZFY-R:5，-GCA CYT CTT TGG TAT CYG AGA AAG T -3，
[0030]內(nèi)對照SRY引物對，其具有如SEQ ID N0.13和SEQ ID N0.14所示的核苷酸序列；
[0031]SRY-F:5’ -GAA TAT TCC CGC TCT CCG GA -3’
[0032]SRY-R:5’ -GCT GGT GCT CCA TTC TTG AG -3’
[0033]SY84位點(diǎn)引物對，其具有如SEQ ID N0.15和SEQ ID N0.16所示的核苷酸序列；
[0034]SY84-F:5’ -AGA AGG GTC TGA AAG CAG GT -3’
[0035]SY84-R:5> -GCC TAC TAC CTG GAG GCT TC -3’
[0036]SY134位點(diǎn)引物對，其具有如SEQ ID N0.17和SEQ ID N0.18所示的核苷酸序列；
[0037]SY134-F:5’ -GTC TGC CTC ACC ATA AAA CG -3’
[0038]SY134-R:5’ -ACC ACT GCC AAA ACT TTC AA -3，
[0039]SY255位點(diǎn)引物對，其具有如SEQ ID N0.19和SEQ ID N0.20所示的核苷酸序列；
[0040]SY255-F:5’ -GTT ACA GGA TTC GGC GTG AT -3’
[0041]SY255-R:5> -CTC GTC ATG TGC AGC CAC -3’。
[0042]一種快速檢測男性Y染色體微缺失檢測試劑盒，所述試劑盒包括:權(quán)利要求1所述擴(kuò)增組合物，PCR反應(yīng)緩沖液，dNTPs，DNA聚合酶。本發(fā)明試劑盒可用于同時(shí)檢測包括Y染色體AZFa亞區(qū)sY84和sY86位點(diǎn)，Y染色體AZFb亞區(qū)sY127和sY134位點(diǎn)，Y染色體AZFc亞區(qū)sY254和sY255位點(diǎn)的基因缺失。
[0043]作為優(yōu)選，PCR反應(yīng)緩沖液包括 3OOmM Ttricine, 25mM(NH4)2SO4,17.5mM MgCl2,30%甘油。PCR反應(yīng)緩沖體系需要增加一種或幾種可以有效地與模板的結(jié)合，降低模板DNA “GC” 二級結(jié)構(gòu)的影響，增加PCR反應(yīng)特異性的添加物。
[0044]作為優(yōu)選，采用的DNA聚合酶為突變型Tag酶Hemo Klen Tag (紐英倫生物技術(shù)(北京)有限公司)。選用的DNA聚合酶能耐受全血中所含的抑制物。
[0045]作為優(yōu)選，dNTPs濃度為2.5mM。
[0046]一種利用所述試劑盒快速檢測男性Y染色體微缺失的方法，所述方法主要包括以下步驟:(1)外周血采集:用肝素抗凝管抽取外周血Iml混勻備用；(2)直接用外周血作為底物進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，進(jìn)行兩組多重PCR反應(yīng)，每套反應(yīng)體系通過權(quán)利要求1所述的擴(kuò)增組合物進(jìn)行多重PCR反應(yīng)；(3)瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物:取10 μ I PCR產(chǎn)物，TAE染色后，經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，電泳電壓120V，電泳時(shí)間90分鐘，通過凝膠成像儀觀察分析。
[0047]該方法無需抽提血DNA，直接使用5 μ I外周血作為擴(kuò)增底物，對常規(guī)多重PCR體系進(jìn)行改良，進(jìn)行兩套強(qiáng)力多重PCR反應(yīng)，每套反應(yīng)體系通過5對引物進(jìn)行多重PCR反應(yīng)，擴(kuò)增5條目標(biāo)片段；(3)取10 μ I PCR產(chǎn)物，瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。采用本發(fā)明所述方法對男性Y染色體缺失基因檢測，具有簡便快速、高效、準(zhǔn)確、低成本等優(yōu)點(diǎn)。
[0048]作為優(yōu)選，25μ I的PCR反應(yīng)體系包括:PCR反應(yīng)緩沖液:300mMTtricine, 25mM(NH4)2SO4,17.5mM MgCl2, 30 %甘油，5 μ I ;全血 2.5 μ I ；2 μ I 2.5mMdNTPs ；I μ I 100單位/ μ I突變型Tag酶Hemo Klen Tag (紐英倫生物技術(shù)(北京)有限公司)；
1.25-2.5 μ M 混合組合引物 2.5 μ I ; 12 μ I H2O0
[0049]作為優(yōu)選，PCR循環(huán)條件為:95°C初始預(yù)變性5min，95°C變性30s，58°C退火90s，72°C延伸60s，35個(gè)反應(yīng)循環(huán)后72°C延伸15min，4°C保存樣品以備下一步實(shí)驗(yàn)用。
[0050]本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明在現(xiàn)有技術(shù)上，對多重PCR緩沖液和Tag聚合酶進(jìn)行改進(jìn)，直接采用微量全血擴(kuò)增，因其用血量少，減少病人的痛苦；免去抽提DNA程序，省時(shí)省力，并且大大減少經(jīng)濟(jì)支出。
【附圖說明】
[0051]圖1為Y染色體微缺失檢測陰性結(jié)果電泳圖；
[0052]圖2為Y染色體微缺失基因檢測結(jié)果的電泳圖；
[0053]圖1和圖2中，從左往右依次為孔道I為DL500 DNA marker，孔道2為空白對照，孔道3為女性全血對照，孔道4 (A組)、5 (B組)為正常男性全血對照，孔道6 (A組)、7 (B組)為檢測樣本，縱坐標(biāo)為DNA分子量。
【具體實(shí)施方式】
[0054]下面通過具體實(shí)施例，對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的具體說明。應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明的實(shí)施并不局限于下面的實(shí)施例，對本發(fā)明所做的任何形式上的變通和/或改變都將落入本發(fā)明保護(hù)范圍。
[0055]在本發(fā)明中，若非特指，所有的份、百分比均為重量單位，所采用的設(shè)備和原料等均可從市場購得或是本領(lǐng)域常用的。下述實(shí)施例中的方法，如無特別說明，均為本領(lǐng)域的常