中篩選、鑒定所述功能抗性基因Pi35。
[0030] 本發(fā)明具有如下明顯的有益效果：
[0031] Pi35基因是一個數(shù)量抗性基因，具有穩(wěn)定、持久的田間抗性，在水稻育種中具有廣 泛的應用價值。
[0032] 本發(fā)明通過比較不同水稻品種Pi35等位基因編碼區(qū)序列，基于Pi35基因特有的 DNA序列位點開發(fā)出一套功能性分子標記Pi35-dCAPS。應用這套標記，以常規(guī)的PCR技術 為基礎輔助以限制性酶切，不僅能夠區(qū)分不同水稻品種資源的Pi35基因型，而且能夠快捷 有效地從育種群體中篩選到攜帶Pi35基因的個體。這套分子標記遺傳穩(wěn)定，不受環(huán)境因素 的影響，可以100%的鑒定出Pi35基因。
[0033] 應用本發(fā)明的功能性分子標記Pi35_dCAPS對目標基因進行常規(guī)雜交或回交轉(zhuǎn) 育，以及與其他基因聚合，其育種選擇目標明確，可以大大節(jié)約時間和成本，提高抗稻瘟病 育種效果。本發(fā)明的分子標記由于源自基因內(nèi)部功能性位點之多態(tài)性，不存在不良性狀的 遺傳重組問題。因此，本發(fā)明提供的分子標記，對于加速水稻稻瘟病抗性基因Pi35在水稻 育種中的應用具有重要意義。
【附圖說明】
[0034] 圖1為藤系138及其衍生品種系譜圖。
[0035] 圖2為Pi35/Pish位點等位基因氨基酸序列比對，其中，箭頭表示Pi35蛋白中第 1260位特異的半胱氨酸。
[0036] 圖3為藤系138、日本晴和LTH對2個稻瘟病菌株的反應型（A)和3個等位基因 Pi35、pi35-LTH 和 Pish 的 RT-PCR 分析（B)。
[0037] 圖4為DNA序列多態(tài)性和標記Pi35_dCAPS引物位置。
[0038] 圖5為Pi35_dCAPS標記在3個水稻品種中的檢測結(jié)果，其中，A為酶切前PCR產(chǎn) 物檢測；B為Tail酶切后PCR產(chǎn)物檢測；M:DNA ladder Trans2K。
[0039] 圖6為Pi35-dCAPS標記對10份藤系138衍生品種的檢測，其中，A為酶切前PCR 產(chǎn)物檢測；B為Tail酶切后PCR產(chǎn)物檢測；M:DNA ladder Trans2K。泳道1-11分別為藤 系138、墾鑒稻3號、墾鑒稻6號、墾稻8號、綏粳3號、龍粳34、墾稻12號、墾稻16號、龍花 00-835、龍粳10號和龍粳13號。
[0040] 圖7為Pi35-dCAPS標記在部分水稻種質(zhì)資源中的檢測結(jié)果，其中，A為為酶切前 PCR產(chǎn)物檢測；B為Tail酶切后PCR產(chǎn)物檢測；M:DNA ladder Trans2K。泳道1-17分別為： 藤系138、撫寧紫皮粳子、細麻線、龍化毛葫蘆、高陽淀稻大紅芒、水原300粒、葉里藏花、中 樓1號、衛(wèi)國、丹東陸稻、興國、老光頭83、白毛稻、木樨球、老虎種、有芒早粳和黃殼早廿日。
【具體實施方式】
[0041] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法（例如：山崎義人、 高坂淖爾編著.稻瘟病與抗病育種（凌忠專、孫昌其譯）.農(nóng)業(yè)出版社，1990;凌忠專著.稻 瘟病研究論文集.中國農(nóng)業(yè)出版社.2005;路鐵鋼等編著.分子遺傳學.高等教育出版社， 2008)。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0042] 實施例1 :品種藤系138中Pi35基因的確認
[0043] 日本水稻品種北海188是Pi35基因克隆的供體親本（Fukuoka等，2014. Multiple functional polymorphisms in a single disease resistance gene in rice enhance durable resistance to blast. Scientific Reports, 4:4550D01:10. 1038/srep04550), 其衍生品種藤系138(圖1)保持了北海188的高水平部分抗性，且經(jīng)遺傳分析證實藤系 138的部分抗性受單個的主效基因控制（Mikami等，Estimation of resistance genes and field resistance to leaf blast of a rice cultivar "Fukei 138，'，Rep. Tohoku Br.，Crop Sci.Soc. Japan 33:87 - 88)。為確認藤系138攜帶Pi35基因，我們利用引物對 SEQ ID N0. 3和SEQ ID N0. 4對藤系138的基因組DNA進行PCR擴增，獲得了 Pi35的等位基 因并命名為Pi35-Fukeil38。對Pi35-Fukeil38測序、拼接和序列比對，發(fā)現(xiàn)Pi35-Fukeil38 的DNA和氨基酸序列與數(shù)據(jù)庫中公布的Pi35的完全一致（圖2)。綜合前人及本發(fā)明研究 結(jié)果，我們確信藤系138攜帶部分抗性基因Pi35。
[0044] 實施例2 :Pi35/Pish位點基因序列比對分析
[0045] 在日本晴中，Pish基因位點包含4個串聯(lián)的NBS-LRR基因（0s01g0781100、 0s01g0781200、0s01g0781700和Pish)，而Pi35是Pish的一個等位變異基因。為了設計和 開發(fā)特異性鑒定Pi35基因的功能性標記，我們首先從水稻數(shù)據(jù)庫中獲得日本晴Pish基因 位點4個基因的編碼區(qū)DNA序列，經(jīng)序列比對發(fā)現(xiàn)第一個基因0s01g0781100與后面3個基 因相似性較低（氨基酸序列一致性分別為65. 7%、65. 6%和65. 53% .)，而后面3個基因之 間則具有很高的序列相似性（表1)。同時利用引物對SEQ ID N0. 3和SEQ ID N0. 4對國內(nèi) 外稻瘟病菌普遍高度感病水稻品種LTH進行基因組DNA擴增，經(jīng)對擴增產(chǎn)物測序獲得了 LTH 中Pi35/Pish的等位基因序列并命名為pi35-LTH(圖2)。隨后，利用Clustal W軟件對5個 基因（Pi35、pi35-LTH、Pish、0s01g0781200 和 0s01g0781700)編碼的蛋白質(zhì)序列進行了多 序列比對分析（圖2)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Pi35與pi35-LTH僅在LRR區(qū)（位置589-1289)存在一個氨 基酸的差異（C1260W);與Pish蛋白在NBS結(jié)構(gòu)域（位置169-588)存在一個氨基酸的替換 (S503P)和一個氨基酸的缺失（510G)，在LRR結(jié)構(gòu)域存在5個氨基酸的差異（1053D/1054E， 1055S/1056R，1072P/1073Q，1082W/1083N 和 1260C/1261W);與 0s01g0781200 和 0801§0782100相比，則分別存在10.93和2.02%的氨基酸序列差異（圖2)。在上述所有 蛋白的變異氨基酸中，第1260位的半胱氨酸為Pi35蛋白所特有，是Pi35與pi35-LTH蛋白 之間差異氨基酸（圖2)。鑒于Pi35基因?qū)θ毡镜疚敛【闗en54-20和Ken53-33表現(xiàn)高 水平的部分抗性，而LTH對這2個菌株表現(xiàn)高度感病（圖3A)，我們推測該氨基酸的差異可 能決定著Pi35與pi35-LTH對鑒別菌株的抗、感病差異。進一步，我們分析了 pi35-LTH基 因的啟動子區(qū)和下游區(qū)序列，發(fā)現(xiàn)Pi35-LTH基因的啟動子區(qū)2041bp和下游1885bp序列 與Pi35基因?qū)男蛄型耆恢拢煌瑫r利用引物對SEQ ID N0. 5和SEQ ID N0. 6對藤系 138中的Pi35、LTH中的pi35-LTH及日本晴的Pish基因進行了 RT-PCR分析，PCR反應體 系如下：2XPCR Buffer for KOD FX lOiil，dNTPs(2mM each)4iil，引物（10pmol，SEQ ID NO. 5+SEQ ID NO. 6) 1 ii 1，KOD FX 酶（1U/ii 1，T0Y0B0) 0? 4 ii 1，cDNA 模板（lOOng/ii 1) 2 ii 1， 加 ddH20 至 20ii 1，擴增反應條件：94°C 2min ;98°C 10s - 59°C 15s - 68°C lmin，33 個循 環(huán)；68°C5min，10°C保存；以水稻OsActin基因作為對照，所用引物對為SEQ ID NO. 7和SEQ ID N0.8 ;結(jié)果表明Pi35、Pish及pi35-LTH等3個基因在各自的背景品種中均能正常表達 (圖3B)。綜合以上分析，我們推斷藤系138和LTH對鑒別菌株的抗與感差異應該與基因的 表達無關，而與基因序列本身的差異（G3780T)有關；第1260位的半胱氨酸是Pi35蛋白的 功能氨基酸，該單個氨基酸的差異區(qū)分了 Pi35的抗病和感病等位基因。
[0046] 表1 Pi35/Pish基因位點氨基酸序列一致性分析
[0047]
【主權項】
1. 一種鑒別或篩選含有稻瘟病抗性基因^碰]水稻品種的方法，其特征在于： 以待測水稻植株或品種的總DNA為模板，采用如SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2所示 序列的引物對進行PCR擴增，如果得到的擴增產(chǎn)物大小為272 bp，并經(jīng)特異限制性內(nèi)切酶 Ail酶切后成為2個片段，大小分別為244 bp和28 bp，則待測水稻植株或品種含有稻瘟 病抗性基因否則待測水稻植株或品種不含有稻瘟病抗性基因
2. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于：采用如SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2所 示序列的引物對進行PCR擴增，其擴增的PCR反應體系如下：2 X PCR Buffer for KOD FX 10 iil，每種 2 mM 的 dNTPs 4 iil，10 pmol 上下游引物 1 iil，l U/iil KOD FX 酶 0.4 yl，100 ng/iil DNA 模板 2 iil，加 ddH20 至 20 iil，擴增反應條件：94°C 2 min;98°C 10 s - 59°C 15 s - 68°C30 s，35 個循環(huán)；68°C 5 min，10°C保存。
3. 根據(jù)權利要求1或2所述方法，其特征在于：采用特異的限制性內(nèi)切酶Ail酶切所 述的PCR擴增產(chǎn)物，其酶切體系和條件如下：PCR產(chǎn)物15 iil，10 X Buffer 2 iil，hi/ 酶1 iil，ddH02 2 iil，65°C酶切3 h后經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。
4. 一種鑒別或篩選含有稻瘟病抗性基因碰]水稻品種的引物對，其特征在于：所述 引物對由SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2所示序列的兩條引物組成。
5. -種含有權利要求4所述的引物對的鑒別或篩選含有稻瘟病抗性基因碰]水稻 品種的試劑盒。
6. -種稻瘟病抗性基因碰]功能性分子標記，其特征在于：利用所述分子標記擴增 的PCR產(chǎn)物序列如SEQ ID NO. 9所示，并且通過特異限制性內(nèi)切酶Ail酶切后成為2個 片段，大小分別為244 bp和28 bp。
7. -種如權利要求4所述的引物對，如權利要求5所述的試劑盒，或如權利要求6所述 的分子標記的應用，其特征在于：將其用于培育水稻抗稻瘟病品種的分子標記輔助育種、基 因聚合育種或轉(zhuǎn)基因育種中。
【專利摘要】本發(fā)明公開了水稻稻瘟病抗性基因Pi35的功能性分子標記Pi35-dCAPS及其方法與應用。通過比對和分析多個水稻品種中Pi35等位基因序列，得到有別于Pi35感病等位基因以及其他稻瘟病抗性基因的Pi35功能特異性位點1處（3780T）；通過設計引物，分別得到SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；利用該引物擴增水稻總DNA,并對擴增產(chǎn)物進行特異性酶切及電泳檢測后獲得Pi35的功能性分子標記Pi35-dCAPS。本發(fā)明可在大量的水稻種質(zhì)資源中篩選、鑒定稻瘟病抗性基因Pi35，以及在分子標記輔助選擇育種、基因聚合育種以及轉(zhuǎn)基因育種中應用。
【IPC分類】C12Q1-68, C12N15-11
【公開號】CN104673917
【申請?zhí)枴緾N201510082155
【發(fā)明人】萬建民, 馬建, 雷財林, 馬小定, 趙志超, 王潔, 王久林, 程治軍, 張欣, 郭秀平
【申請人】中國農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所
【公開日】2015年6月3日
【申請日】2015年2月15日