對單核苷酸KRAS突變特異的雙功能短發(fā)夾RNA(bi-shRNA)的制作方法
【專利說明】對單核苷酸KRAS突變特異的雙功能短發(fā)夾RNA(bi-shRNA)
[0001] 相關(guān)申請的交叉引用
[0002] 發(fā)明的摶術(shù)領(lǐng)域
[0003] 本發(fā)明一般性涉及癌癥治療領(lǐng)域，更具體地涉及針對K-ras突變的特異性雙功能 shRNA。
[0004] 發(fā)明背景
[0005] 在不限定本發(fā)明范圍的情況下，結(jié)合K-ras描述本發(fā)明的背景。
[0006]KRAS(Kirsten-raS)癌基因在胰腺導(dǎo)管腺癌（PDAC)、結(jié)腸直腸癌和非小細胞肺癌 (NSCLC)中發(fā)生突變的比例很大。在攜帶KRAS突變的大多數(shù)PDAC(70-90%)患者中，五年 存活率小于5%。KRAS是結(jié)合鳥嘌呤核苷酸的蛋白家族的成員并且是包括表皮生長因子受 體（EGFR)的多個細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)途徑的必要組分。絕大多數(shù)KRAS中的突變?yōu)閱魏塑账?體細胞突變，導(dǎo)致在密碼子12或13處發(fā)生單個氨基酸置換。>90%的PADC患者中發(fā)現(xiàn)的 KRAS突變?yōu)镚12D、G12V、G12R和G12CKRAS突變。KRAS突變基本上形成組成型活化KRAS 和未調(diào)節(jié)的下游信號傳遞。
[0007] 祀向試劑如抗體西妥昔單抗（Cetuximab)(在結(jié)腸直腸癌中）和小分子抑制劑威 羅菲尼（vemurafenib)(在BRAF突變的黑色素瘤中）在具有KRAS突變的患者中表現(xiàn)差。因 此，有效的癌癥治療策略需要不損害野生型功能的KRAS突變選擇性。仍非常需要用于具有 KRAS突變的癌癥的組合物、方法和治療。
[0008] 發(fā)明概沭
[0009] 在一個實施方案中，本發(fā)明包括能夠降低K-ras基因表達的雙功能shRNA，其中所 述雙功能RNA分子的至少一個靶位點序列位于K-ras基因內(nèi)，其中所述雙功能RNA分子能 夠激活切割依賴性和非切割依賴性RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物，用于降低K-ras的表達水平。 一方面，雙功能shRNA包含至少一條由SEQIDNO: 1至22定義的序列。另一方面，雙功能 shRNA包含至少一條由SEQIDN0:31至52或53至56定義的序列。另一方面，所述至少 一個靶位點序列位于人K-ras基因cDNA序列（SEQIDN0:27至30)內(nèi)。另一方面，所述 K-ras為突變的K-ras。另一方面，雙功能shRNA包含靶向至特異性K-ras突變的三聯(lián)體插 入片段（tripletinsert)，所述三聯(lián)體插入片段選自SEQIDNO. :2、18、20、21，*SEQID NO:2、18和20的組合；或SEQIDNO:21、2和18的組合。
[0010] 在一個實施方案中，本發(fā)明包括表達載體，所述表達載體包含啟動子和可操作地 連接到該啟動子的核酸插入片段，其中插入片段編碼一個或多個ShRNA，所述一個或多個 shRNA能夠通過RNA干擾抑制至少一個靶基因的表達，所述靶基因為K-ras基因；其中所述 一個或多個shRNA包含雙功能RNA分子，所述雙功能RNA分子激活切割依賴性和非切割依 賴性RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物，用于降低K-ras的表達水平。一方面，靶基因序列包含SEQID NO: 1至5。另一方面，shRNA的序列排列包含5'莖臂-19核苷酸靶點，所述5'莖臂-19核 苷酸靶點為K-ras-TA-15核苷酸環(huán)-19核苷酸靶點互補序列-3'莖臂-間隔區(qū)-5'莖臂-19 核苷酸靶點變體-TA-15核苷酸環(huán)-19核苷酸靶點互補序列-3'莖臂。另一方面，核酸插入 片段包含至少一條選自SEQIDN0:6至27的序列。另一方面，至少一個shRNA具有位于突 變的K-ras基因cDNA序列內(nèi)的靶位點序列。另一方面，本發(fā)明包括治療遞送系統(tǒng)，所述治 療遞送系統(tǒng)包括治療劑載體和表達載體，所述表達載體包含啟動子和可操作地連接到該啟 動子的核酸插入片段，所述核酸插入片段編碼一個或多個短發(fā)夾RNA(shRNA)，所述一個或 多個短發(fā)夾RNA能夠通過RNA干擾抑制靶基因序列的表達，所述靶基因序列為K-ras基因； 其中所述一個或多個shRNA包含雙功能RNA分子，所述雙功能RNA分子激活切割依賴性和 非切割依賴性RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物，用于降低K-ras的表達水平。另一方面，所述治療劑 載體為壓縮的DNA納米顆粒。另一方面，DNA納米顆粒與一個或多個聚陽離子一起壓縮。另 一方面，所述一個或多個聚陽離子為lOkDA聚乙二醇（PEG)-取代的半胱氨酸-賴氨酸3聚 體肽（CK30PEG10k)。另一方面，所述壓縮的DNA納米顆粒進一步包封在脂質(zhì)體中。另一方 面，所述脂質(zhì)體為兩層內(nèi)陷的囊泡（BIV)。另一方面，所述脂質(zhì)體為可逆掩蔽的脂質(zhì)體。另 一方面，所述治療劑載體為脂質(zhì)體。另一方面，所述靶基因序列包含SEQIDNO:27至30。 另一方面，所述核酸插入片段包含至少一條選自SEQIDNO: 31至52或53至56的序列。另 一方面，所述插入片段選自SEQIDN0:l-22。另一方面，所述雙功能shRNA包含靶向至特異 性K-ras突變的三聯(lián)體插入片段，所述三聯(lián)體插入片段選自SEQIDNO. :2、18、20、21、55，或 SEQIDNO:2、18 和 20 的組合；或SEQIDNO:21、2 和 18 的組合。
[0011] 在一個實施方案中，本發(fā)明包括用于將一個或多個shRNA遞送至表達K-ras基因 的靶組織的方法，所述方法包括以下步驟：制備表達載體，所述表達載體包含啟動子和可操 作地連接到該啟動子的核酸插入片段，所述核酸插入片段編碼一個或多個shRNA，其中所述 一個或多個shRNA包含雙功能RNA分子，所述雙功能RNA分子激活切割依賴性和非切割依 賴性RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物，用于降低K-ras的表達水平；將所述表達載體與治療劑載體組 合，其中所述治療劑載體包含脂質(zhì)體；和給予有需要的患者治療有效量的表達載體和治療 劑載體復(fù)合物。一方面，所述治療劑載體為壓縮的DNA納米顆粒。另一方面，所述DNA納米 顆粒與一個或多個聚陽離子一起壓縮，其中所述一個或多個聚陽離子包含lOkDA聚乙二醇 (PEG)-取代的半胱氨酸-賴氨酸3聚體肽（CK30PEG10k)或30聚體賴氨酸縮合肽。另一方 面，所述壓縮的DNA納米顆粒進一步包封在脂質(zhì)體中，其中所述脂質(zhì)體為兩層內(nèi)陷的囊泡 (BIV)并使用一個或多個"巧妙的（smart)"受體靶向部分裝飾。另一方面，所述一個或多 個"巧妙的（smart)"受體靶向部分是小分子二價轉(zhuǎn)角模擬物。另一方面，所述脂質(zhì)體 為可逆掩蔽的脂質(zhì)體。另一方面，所述脂質(zhì)體為兩層內(nèi)陷的囊泡（BIV)。另一方面，所述脂 質(zhì)體為可逆掩蔽的脂質(zhì)體。另一方面，所述一個或多個"巧妙的（smart)"受體靶向部分是 小分子的二價轉(zhuǎn)角模擬物。另一方面，所述核酸插入片段包含選自SEQIDNO: 1至22 或53至56的序列。另一方面，所述雙功能shRNA包含靶向至特異性K-ras突變的三聯(lián)體 插入片段，所述三聯(lián)體插入片段選自3￡〇10勵.：2、18、20、21，或5￡〇10勵:2、18和20的 組合；或SEQIDN0:21、2和18的組合。
[0012] 在一個實施方案中，本發(fā)明包括用于抑制K-ras基因在一個或多個靶細胞中表達 的方法，所述方法包括以下步驟：選擇一個或多個靶細胞；并用載體轉(zhuǎn)染所述靶細胞，所述 載體表達一個或多個短發(fā)夾RNA(shRNA)，所述一個或多個短發(fā)夾RNA能夠通過RNA干擾抑 制K-ras基因在一個或多個靶細胞中的表達，其中所述一個或多個shRNA包含雙功能RNA 分子，所述雙功能RNA分子激活切割依賴性和非切割依賴性RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物，用于降 低K-ras的表達水平。另一方面，所述shRNA合并siRNA(切割依賴性）和miRNA(非切割 依賴性）基序。另一方面，所述雙功能shRNA包含靶向至特異性K-ras突變的三聯(lián)體插入 片段，所述三聯(lián)體插入片段選自SEQIDNO. :2、18、20、21，或5￡〇10勵:2、18和20的組合； 或SEQIDN0:21、2和18的組合。
[0013] 在一個實施方案中，本發(fā)明包括抑制人受試者中腫瘤細胞生長的方法，所述方法 包括以下步驟：鑒別需要抑制腫瘤細胞生長的人受試者；和以足以抑制腫瘤細胞生長的量 給予人受試者治療劑載體復(fù)合物中的表達載體，其中所述表達載體表達一個或多個shRNA， 所述一個或多個shRNA能夠通過RNA干擾抑制靶基因在一個或多個靶細胞中的表達，所述 靶基因為K-ras，其中所述一個或多個shRNA包含雙功能RNA分子，所述雙功能RNA分子激 活切割依賴性和非切割依賴性RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物，用于降低靶基因的表達水平；其中 所述抑制導(dǎo)致腫瘤細胞的細胞凋亡、增殖受阻或侵襲性降低。另一方面，所述治療劑載體包 含兩層內(nèi)陷的囊泡（BIV)。另一方面，所述治療劑載體包含一個或多個"巧妙的"受體靶向 部分，所述一個或多個"巧妙的"受體靶向部分為小分子二價轉(zhuǎn)角模擬物。另一方面， 所述給予的步驟選自皮下、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)和靜脈內(nèi)注射。另一方面，所述給予的步驟 包括瘤內(nèi)注射。另一方面，所述給予的步驟包括使用DNA:脂質(zhì)體復(fù)合物（lipoplex)進行 注射。另一方面，所述腫瘤細胞生長表達K-ras。另一方面，所述腫瘤細胞生長為人胰腺導(dǎo) 管腺癌。另一方面，所述腫瘤細胞生長選自肺癌、結(jié)腸癌、黑色素瘤、胰島素瘤、間皮瘤、卵巢 癌和胰腺癌。另一方面，所述腫瘤細胞生長為胰腺癌。另一方面，所述bishRNA選自SEQ ID NO: 1至22或53至56。另一方面，所述雙功能shRNA包含靶向至特異性K-ras突變的三聯(lián) 體插入片段，所述三聯(lián)體插入片段選自SEQ IDN0.:2、18、20、21，或5￡〇10勵:2、18和20 的組合；或SEQ IDN0:21、2和18的組合。另一方面，所述方法可以進一步包括與第二抗瘤 劑的聯(lián)合治療。另一方面，所述方法可以進一步包括與西妥昔單抗或威羅菲尼的聯(lián)合治療。
[0014] 本發(fā)明的另一個實施方案包括表達載體，所述表達載體包含能夠降低突變的 K-ras基因表達的 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、13、14、15、16、17、18、20、21、25、50、75 或 100個雙功能shRNA插入片段，其中所述雙功能RNA插入片段的至少一個靶位點序列位于 K-ras基因內(nèi)，其中所述雙功能RNA分子能夠激活切割依賴性和非切割依賴性RNA誘導(dǎo)的 沉默復(fù)合物，用于降低K-ras的表達水平。一方面，所述雙功能shRNA選自SEQIDNO: 1至 22或53至56。另一方面，所述雙功能shRNA包含靶向至特異性K-ras突變的三聯(lián)體插入 片段，所述特異性K-ras突變選自G12D-G12V-G12R、G12C-G12D-G12R、G12D-G12V-G12R或 G12C-G12D-G12R中的至少一個。另一方面，所述雙功能shRNA包含靶向至特異性K-ras突 變的三聯(lián)體插入片段，所述三聯(lián)體插入片段選自SEQIDNO. :2、18、20、21，*SEQIDN0:2、 18和20的組合；或SEQIDNO:21、2和18的組合。
[0015] 本發(fā)明的另一個實施方案包括含有表達載體的細胞，所述表達載體包含能夠降低 突變的K-ras基因的表達的 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、13、14、15、16、17、18、20、21、25、 50、75或100個雙功能shRNA插入片段，其中所述雙功能RNA分子的至少一個靶位點序列位 于K-ras基因內(nèi)，其中所述雙功能RNA分子能夠激活切割依賴性和非切割依賴性RNA誘導(dǎo) 的沉默復(fù)合物，用于降低K-ras的表達水平。一方面，所述雙功能shRNA選自SEQIDNO: 1 至22或53至56。另一方面，所述雙功能shRNA提高了未突變的K-ras的表達。另一方面， 所述雙功能shRNA包含靶向至特異性K-ras突變的三聯(lián)體插入片段，所述三聯(lián)體插入片段 選自SEQIDN0. :2、18、20、21，或SEQIDN0:2、18 和 20 的組合；或SEQIDN0:21、2 和 18 的組合。
[0016] 本發(fā)明的另一個實施方案包括評價被認為在治療包含至少一個突變的K-ras的 細胞或組織中有用的候選藥物的方法，所述方法包括：(a)測量至少一個野生型K-ras和一 個或多個突變型K-ras基因在細胞或組織中的表達水平；(b)將候選藥物給予第一亞組的 細胞或組織，并將安慰劑給予第二亞組的細胞或組織；（c)在給予候選藥物或安慰劑之后， 重復(fù)步驟（a);和（d)確定與第二亞組的細胞或組織中發(fā)生的任何降低相比，候選藥物是否 相比野生型K-ras在統(tǒng)計學(xué)上顯著降低突變型K-ras的表達，其中在統(tǒng)計學(xué)上顯著的降低 表明候選藥物在治療K-ras誘導(dǎo)的疾病中是有用的。一方面，所述細胞或組織進一步表達 一個或多個已經(jīng)修飾為包含野生型K-ras和一個或多個突變型K-ras的可檢測基因，其中 可檢測標記的表達水平與候選物質(zhì)對野生型K-ras和一個或多個突變型K-ras的作用相關(guān) 聯(lián)。另一方面，所述細胞或組織已被修飾為表達能夠降低K-ras基因表達的雙功能shRNA， 其中所述雙功能RNA分子的至少一個靶位點序列位于K-ras基因內(nèi)并且其中所述雙功能 RNA分子能夠激活切割依賴性和非切割依賴性RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物，用于降低K-ras的表 達水平。
[0017] 本發(fā)明的另一個實施方案包括評價被認為在治療細胞或組織中有用的候選藥物 的方法，所述細胞或組織包含至少一個被有效地沉默的突變的K-ras，所述方法包括：(a) 測量以下中的一個或多個：a.至少一個野生型K-ras和一個或多個突變型K-ras基因在細 胞或組織中的表達水平；b. -個候選基因或一組候選基因在癌細胞或組織中在一個或多 個突變的K-ras基因的表達降低的細胞環(huán)境下的表達水平；c.候選藥物對癌細胞或組織中 由一個或多個突變的K-ras基因降低的表達組成的細胞表型的作用；(b)將候選藥物給予 第一亞組的所述細胞或組織，并將安慰劑給予第二亞組的所述細胞或組織；（c)在給予候 選藥物或安慰劑之后重復(fù)步驟（a);和（d)確定與表達K-ras突變型的細胞環(huán)境相比，在 突變的K-ras表達降低的細胞環(huán)境下，候選藥物是否有效產(chǎn)生確定的表型，即所述突變的 K-ras表達降低與第二亞組細胞或組織中發(fā)生的任何降低相比是統(tǒng)計學(xué)上顯著的，其中統(tǒng) 計學(xué)上顯著的降低表明候選藥物在治療沒有顯著的K-ras突變背景的疾病中是有效的。一 方面，所述細胞或組織進一步表達一個或多個已經(jīng)修飾為包含野生型K-ras和一個或多個 突變型K-ras的可檢測基因，其中可檢測標記的表達水平與候選物質(zhì)對野生型K-ras和一 個或多個突變型K-ras的作用相關(guān)聯(lián)。另一方面，所述細胞或組織已被修飾為表達能夠降 低K-ras基因表達的雙功能shRNA，其中所述雙功能RNA分子的至少一個靶位點序列位于 K-ras基因內(nèi)并且其中所述雙功能RNA分子能夠激活切割依賴性和非切割依賴性RNA誘導(dǎo) 的沉默復(fù)合物，用于降低K-ras的表達水平。另一方面，所述細胞或組織已被修飾為表達 雙功能shRNA，所述雙功能shRNA包含靶向至特異性K-ras突變的一個或多個插入片段，所 述一個或多個插入片段選自3￡〇10勵.：2、18、20、21，或5￡〇10勵 :2、18和20的組合；或 SEQIDN0:21、2 和 18 的組合。
[0018]附圖的簡要說明
[0019] 為了更完全地理解本發(fā)明的特征和優(yōu)點，現(xiàn)參考本發(fā)明的詳述和所附的附圖，其 中：
[0020] 圖1顯示了測試載體的示意圖。將野生型KRAS的前17個氨基酸插入psiCHECK2 載體的海腎（Renilla)熒光素酶基因（hRluc)的氨基末端，同時將G12D、G12V、G12R或G12C KRAS突變型的前17個氨基酸插入相同載體的螢火蟲（Firefly)熒光素酶基因（hluc+)的 氨基末端。
[0021] 圖2顯示了測試載體對野生型和突變型表達的效果。使用Dual-Glo熒光素酶檢 測系統(tǒng)（Promega)比較每個測試載體與親本psiCHECK2載體的野生型（Wt)和突變型（Mu) 表達。通過海腎（RL)與螢火蟲（FF)的表達比率來評估Wt與Mu的表達比較。
[0022] 圖3A至3C為本發(fā)明的檢測系統(tǒng)的闡釋。通過測試載體與雙功能shRNA(bi-shRNA) 表達載體（86、87、88、89、90、91或92,分別為SEQIDNO. :1至7)的共轉(zhuǎn)染，可以通過FF與 RL的比率（圖a)快