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      一種核酸快速提取裝置及方法_2

      文檔序號:8375815閱讀:來源:國知局
      中,第一腔體21的底部內(nèi)側(cè)設(shè)置有微孔過濾膜26,該微孔過濾膜位 于水平分隔體24上方,水平分隔體24設(shè)置有連通第二腔體的出液孔25,從而實(shí)現(xiàn)離心過程 液體的連通,并最終將液體離心至離心柱下方套接收的離心管10中。當(dāng)然在本發(fā)明的其他 實(shí)施例中,將微孔過濾膜設(shè)置于水平分隔體24與離心柱底部24之間,并保證核酸吸附膜位 于微孔過濾膜的下方,也能夠解決本發(fā)明的技術(shù)問題,達(dá)到相應(yīng)技術(shù)效果。
      [0023] 在本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施例中,離心柱20頂部設(shè)置有分別與第一腔體21和第二腔體22 連接的開口 30,離心柱底部的內(nèi)側(cè)設(shè)置有核酸吸附膜29。其中,離心柱20底部設(shè)置有具有 通孔28的裝載封蓋27,該核酸吸附膜27離心時承托于裝載封蓋27并卡嵌在離心柱20的 下端部內(nèi)側(cè),同時,為了在核酸提取步驟中的吸附步驟中有效地吸附在第一腔體21中經(jīng)過 裂解、結(jié)合、漂洗而獲得的樣品中的核酸,核酸吸附膜位于第二腔體22內(nèi)并介于水平分隔 體下方與離心柱底部的內(nèi)側(cè),從而高效率的獲取得到樣品中的核酸。需要說明的是,當(dāng)本發(fā) 明的核酸快速提取裝置用于痕量(如法醫(yī)鑒定)樣品的核酸提取時,直接將收集痕量樣品的 拭子、棉簽、精斑、血斑、煙蒂等檢材直接放置于第一腔體21,經(jīng)過經(jīng)典的核酸提取步驟中所 采用的裂解、結(jié)合、漂洗步驟,使樣品中的核酸充分收集從而達(dá)到高效率提取的目的,有效 避免因拭子、棉簽、精斑、血斑、煙蒂等檢材的吸附和離心管壁的吸附而造成微量核酸物證 的損失,提尚核酸提取效率。
      [0024] 另外,關(guān)于離心管的使用,本發(fā)明主要是通過離心柱的改進(jìn)從而達(dá)到提高核酸提 取效率以及避免交叉污染的技術(shù)效果,在本發(fā)明的其他實(shí)施例中,如果僅僅處于上述技術(shù) 目的,本發(fā)明的方案中可以不包含離心管的設(shè)置。另外對于離心管的選擇也可以參照現(xiàn)有 技術(shù)選擇與本發(fā)明技術(shù)方案中匹配的各種類型的離心管作為液體收集裝置。當(dāng)然需要說明 的是,由于在核酸提取的結(jié)合、漂洗、洗脫步驟中均包含離心步驟,在結(jié)合、漂洗步驟中離心 管可以視情況而定考慮是否更換,而最后的洗脫步驟中,核酸最終通過該步驟收集與離心 管中,因此,洗脫步驟中需要更換原先步驟中所用離心管。
      [0025] 從提取效果上來看,核酸吸附膜及微孔過濾膜的選擇均非常重要,直接關(guān)系到核 酸提取的效率以及最終提取的核酸的質(zhì)量,因此,在本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施例中微孔過濾膜為聚 醚砜膜,而核酸吸附膜為玻璃纖維膜。其中,聚醚砜膜具有物理、化學(xué)性能穩(wěn)定,有很好的相 容性,且其孔徑,孔隙率高、納污量大、可反沖和高溫消毒的特點(diǎn),有效地濾除樣品中核酸外 雜質(zhì)。而或者玻璃纖維膜具有良好的核酸吸附性能,將樣品中的核酸成分充分有效地吸附, 保證核酸提取效率。另外,在本發(fā)明的其他實(shí)施例中,也可以根據(jù)具體的需要,在保證核酸 提取效率及質(zhì)量的前提下,選擇其他成分的微孔過濾膜或者核酸吸附膜也是完全可行的, 例如,選擇采用硅膠膜作為核酸吸附膜也是完全可行的。
      [0026] 具體實(shí)現(xiàn)時,本發(fā)明實(shí)施例中采用的離心柱的水平橫截面為圓形,豎直分隔體分 割離心柱水平橫截面圓形直徑的3/4至4/5。同時為了保證有效分隔及核酸吸附膜的充分 吸附,水平分隔體距離心柱底部內(nèi)側(cè)的核酸吸附膜2-5mm。
      [0027] 當(dāng)然,作為優(yōu)化方案,核酸快速提取裝置還包括蓋合離心柱頂部設(shè)置的開口 30的 管蓋31。在本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施例中,管蓋銜接設(shè)置于離心柱的頂部邊緣在加入樣品或者相應(yīng) 緩沖液后都需要進(jìn)行閉管操作,以避免交叉污染。當(dāng)然,在本發(fā)明的其他實(shí)施例中,也可以 將管蓋銜接設(shè)置于離心管的頂部邊緣,在離心柱放入離心管時,也能夠通過銜接設(shè)置于離 心管的頂部邊緣的管蓋合離心柱頂部的開口 30。
      [0028] 另一方面,本發(fā)明實(shí)施例還提供了一種基于上述核酸快速提取裝置實(shí)現(xiàn)的核酸快 速提取方法,依次包括如下步驟: (1)裂解:將待測樣品或者附著有待測樣品的檢測材料放入離心柱第一腔體中,加入 150-300ul裂解液,于 56-65°C加熱裂解 10_30min; (2) 結(jié)合:靜置冷卻至室溫,向離心柱第一腔體中加入結(jié)合液150-300ul,混勻, 6000-20000g離心l_2min; (3) 漂洗:向離心柱第一腔體加入300-500ul漂洗液A,6000-20000g離心l-2min;然 后再向離心柱第一腔體加入300-500ul漂洗液B,6000-20000g離心l-2min;空管20000g 離心 2_5min; (4) 洗脫:向離心柱第二腔體中加入20-lOOul洗脫液至核酸吸附膜上,室溫靜置 5-lOmin,20000g離心 2min。
      [0029] 其中,所述裂解液中含有如下含量的成分:胍鹽0. 1-1M,胍鹽濃度優(yōu)選0. 2M,胍鹽 優(yōu)選鹽酸胍、異硫氰酸酸胍的一種或其組合;十二烷基磺酸鈉或十二烷基硫酸鈉0.1- 4%, 優(yōu)選l%;TrisImM- 20mM,優(yōu)選 10mM;CaC12l-10mM,優(yōu)選 2mM;TritonX-100 0.1-3%,優(yōu) 選1. 5% ;裂解液pH值7. 2-8. 0,優(yōu)選7. 5。優(yōu)選地,在裂解步驟中還可以與裂解液一同添加 蛋白酶K2-20U每次(每人份),優(yōu)選12U每次(每人份)。
      [0030] 所述結(jié)合液中含有如下含量的成分:胍鹽1-6M,胍鹽濃度優(yōu)選4M,胍鹽優(yōu)選鹽酸 胍、異硫氰酸酸胍的一種或其組合;聚合度為6000-20000的聚乙二醇10-40%,聚乙二醇聚 合度優(yōu)選8000,聚乙二醇濃度優(yōu)選30%;無水乙醇30-80% (v/v),優(yōu)選50%;TrisImM- 20 mM,優(yōu)選10mM;結(jié)合液pH值6-7.5,優(yōu)選7.0。
      [0031] 所述漂洗液A中含有如下含量的成分:胍鹽0. 1-2M,胍鹽濃度優(yōu)選1M,胍鹽優(yōu)選鹽 酸胍、異硫氰酸酸胍的一種或其組合;EDTAl-10mM,優(yōu)選2mM;無水乙醇30-80%(v/v),優(yōu)選 50%;1'1^11111-2〇1111,優(yōu)選1〇1111;漂洗液六的口11值為6-7.5,優(yōu)選7.0。
      [0032] 所述漂洗液B:NaC10. 1-2M,優(yōu)選0.5M;TrisImM- 20禮,優(yōu)選10mM;無水乙醇 30-80% (v/v),優(yōu)選50% ;漂洗液B的pH值為6-7. 5,優(yōu)選7. 0。
      [0033] 所述洗脫液為去離子水或pH8. 0的10mMTris-HCl。
      [0034] 結(jié)合上述實(shí)現(xiàn)方式,本發(fā)明還提供了如下實(shí)施例對本發(fā)明的核酸快速提取方法進(jìn) 行進(jìn)一步詳細(xì)說明: 實(shí)施例1 本發(fā)明的核酸快速提取裝置拭子檢材中的全血DNA,包括以下步驟: (1)準(zhǔn)備模擬拭子檢材 將無菌Omni拭子放入本發(fā)明離心柱第一腔體21中,按壓桿的末端,彈出拭子,向拭子 上加入50ul新鮮EDTA抗凝小鼠全血,作為模擬拭子檢材。
      [0035] (2)裂解 向拭子上加入200ul裂解液(Lysisbuffer)和20ul蛋白酶K,蓋上管蓋,65°C裂解 20min〇
      [0036] (3)結(jié)合 向拭子上加入200ul結(jié)合液(bindingbuffer),混勾后,20000g離心2min。
      [0037] (4)漂洗 向離心柱第一腔體中加入500ul漂洗液A(washbufferA),蓋好管蓋,12000g離心lmin,將離心柱轉(zhuǎn)移到新的收集管中,加入500ul漂洗液B(washbufferB),蓋好管蓋,再 次12000g離心lmin,將離心柱轉(zhuǎn)移到新的收集管中,20000g離心2min。
      [0038] (5)離心柱轉(zhuǎn)移至新的離心管中,從離心柱的第二腔體22中往核酸吸附膜上加入 50ul洗脫液(Elutionbuffer),室溫放置5min,20000g離心lmin,丟棄離心柱,離心管中 的DNA溶液用于檢測或-20°C儲存。
      [0039] 實(shí)施例2 常規(guī)離心柱法提取拭子檢材中的全血DNA,包括以下步驟: (1)準(zhǔn)備模擬拭子檢材 將無菌Omni拭子放入1. 5ml離心管中,按壓桿的末端,彈出拭子,向拭子上加入50ul新鮮EDTA抗凝小鼠全血,作為模擬拭子檢材。
      [0040] (2)裂解 向拭子上加入200ulLysisbuffer和20ul蛋白酶K,蓋上管蓋,65°C裂解20min。
      [0041] (3)結(jié)合 向拭子上加入200ulbindingbuffer,混勾后,12000g離心lmin,將上清液轉(zhuǎn)移至常規(guī) 離心柱中,12000g離心lmin,將離心柱轉(zhuǎn)移到新的收集管中。
      [0042] (4)漂洗 向離心柱中加入500ulwashbufferA,蓋好管蓋,12000g離心lmin,將離心柱轉(zhuǎn)移到 新的收集管中,加入500ulwashbufferB,蓋好管蓋,再次12000g離心lmin,將離心柱轉(zhuǎn) 移到新的收集管中,20000g離心2min。
      [0043] (5)離心柱轉(zhuǎn)移至新的離心管中,向離心柱正中央加入50ulElutionbuffer,室 溫放置5min,20000g離心lmin,丟棄離心柱,離心管中的DNA溶液用于檢測或-20°C儲存。
      [0044] 實(shí)施例3 : 本發(fā)明的核酸快速提取裝置提取血斑檢材中的DNA,包括以下步驟: (1)準(zhǔn)備模擬血斑檢材 切下0. 5cm2牛仔織物,向牛仔織物上加入50ul新鮮EDTA抗凝小鼠全血,室溫放置1 小時,使其自然干燥,作為模擬血斑檢材。然后將模擬血斑檢材剪成小塊,放入本離心柱第 一腔體21中。
      [0045] (2)裂解 向模擬血斑檢材上加入200ulLysisbuffer和20ul蛋白酶K,蓋上管蓋,65°C裂解 20min〇
      [0046] (3)結(jié)合 向模擬血斑上加入200ulbindingbuffer,混勾后,20000g離心2
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