一種蠟樣芽孢桿菌及其制劑及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，涉及一種蠟樣芽孢桿菌、其篩選方法、制 劑及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 抗生素被廣泛用于我國畜牧業(yè)養(yǎng)殖中，并以其本體或轉(zhuǎn)化形態(tài)隨著動物糞便和尿 液排入環(huán)境，并在環(huán)境中蓄積，造成環(huán)境中抗生素污染?？股剡M(jìn)入環(huán)境后會破壞環(huán)境中原 有微生物種類平衡，從而導(dǎo)致相應(yīng)生態(tài)系統(tǒng)失衡。另外，環(huán)境中的土霉素還可以通過生物鏈 進(jìn)入人體，對人體健康造成威脅。為此，我國科技部啟動國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃（863計 劃），設(shè)立"集約養(yǎng)殖外源化學(xué)品污染控制技術(shù)"重大專項(xiàng)，主要針對集約養(yǎng)殖場造成的抗生 素污染從源頭上進(jìn)行處理。土霉素作為目前使用量最大的獸用抗生素，成為科技攻關(guān)的核 心問題。
[0003] 近年來，殘留抗生素在環(huán)境中的降解、轉(zhuǎn)化、遷移、歸趨和對動植物、微生物等影響 有關(guān)的研究很多并呈上升趨勢，成為國內(nèi)外研究熱點(diǎn)，但是有關(guān)如何削減環(huán)境中殘留抗生 素的研究目前還比較少見。
[0004] 目前抗生素污染控制技術(shù)主要包括物理、化學(xué)及生物處理技術(shù)?？股氐奈锢砣?除方法主要有活性炭吸附、膠體吸附、絮凝沉淀以及膜過濾等方法。而抗生素的化學(xué)去除方 法現(xiàn)在以離子法為主。由于抗生素的生物降解相對其他物理、化學(xué)方法，具有成本低廉、環(huán) 境影響較小的獨(dú)特優(yōu)勢，目前以受到廣泛關(guān)注，而微生物在其中的作用也得到了重點(diǎn)研究。 許曉玲等從長期堆放四環(huán)素藥渣的土壤中篩選四環(huán)素降解菌株兩株，分別為缺陷短波單胞 菌和人蒼白桿菌。它們均可利用四環(huán)素作為碳源生長。李麗等通過研究最終找到一種對 氯嘧磺隆10mg/L的降解率為94. 78%細(xì)菌。
[0005] 土霉素作為使用最為廣泛的抗生素，目前其污染控制技術(shù)主要為堆肥，相應(yīng)的土 霉素降解率僅為40%左右。因此，迫切需要找到一種堆肥強(qiáng)化手段以提高土霉素降解率。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 針對現(xiàn)有技術(shù)的以上缺陷或改進(jìn)需求，本發(fā)明提供了一種土霉素高效降解菌，其 目的在于降解土霉素，由此解決普通不加菌堆肥法降解土霉素效率低下的技術(shù)問題。
[0007] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，按照本發(fā)明的一個方面，提供了一種能夠降解土霉素的蠟樣芽 孢桿菌，其分類命名為蠟樣芽孢桿菌0214Bacilluscereus0214,于2014年3月5日保藏 于中國典型培養(yǎng)物保藏中心CCTCC，保藏編號為CCTCCM2014061，保藏地中國武漢。
[0008] 按照本發(fā)明的另一方面，提供了一種篩選土霉素高效降解菌的方法，包括以下步 驟：
[0009] (1)單菌落培養(yǎng)：取受土霉素污染的豬糞制備成菌懸液，將菌懸液加入到基礎(chǔ)培 養(yǎng)基中，培養(yǎng)出細(xì)菌單菌落；所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基含有400yg/ml至500yg/ml的放線菌酮；
[0010] (2) 土霉素篩選：將步驟（1)中獲得的細(xì)菌單菌落，分別加入含土霉素的基礎(chǔ)培養(yǎng) 基，不斷提高基礎(chǔ)培養(yǎng)基中土霉素的濃度直至不低于200mg/L，保留能適應(yīng)所述土霉素濃度 的細(xì)菌單菌落；
[0011] (3) 土霉素降解菌篩選：將步驟（2)中獲得的細(xì)菌單菌落，分別加入無機(jī)鹽培 養(yǎng)基培養(yǎng)，不斷提高土霉素濃度直至不低于200mg/L，分時段測定培養(yǎng)基內(nèi)土霉素含量和 0D600,計算土霉素降解率，保藏土霉素降解率不低于50 %且0D600不低于0. 2的細(xì)菌；
[0012] 所述無機(jī)鹽培養(yǎng)基每升含：NaH2P040 . 05 % ~0? 1 %、K2HP040. 05 % ~0? 1 %、 (NH4) 2S04〇m，pH值在 7. 0 至 7. 4 之間。
[0013] 按照本發(fā)明的另一方面，提供了一種蠟樣芽孢桿菌制劑，包括所述的蠟樣芽孢桿 菌干粉和有機(jī)基質(zhì)，所述芽孢桿菌干粉和有機(jī)基質(zhì)質(zhì)量比例在1:4至1:5之間。
[0014] 優(yōu)選地，所述蠟樣芽孢桿菌制劑，其特征在于，所述有機(jī)基質(zhì)為腐殖酸、玉米粉、淀 粉、麩皮中的一種或多種；優(yōu)選腐殖酸。
[0015] 按照本發(fā)明的另一方面，提供了一種所述蠟樣芽孢桿菌制劑的制備方法，包括以 下步驟：
[0016] (a)將如權(quán)利要求1所述的蠟樣芽孢桿菌種子液接入發(fā)酵罐培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)，接種 量為2 % -5 %，直至形成芽孢不低于90%，獲得發(fā)酵液；所述發(fā)酵罐培養(yǎng)基的配置如下： 大豆粉6~7 %、玉米粉7~8 %、麩皮1 %~2 %、腐殖酸0? 5 %~1 %、NaH2P040 . 05 %~ 0? 1%、K2HP040. 05%~0? 1%和（NH4)2S040. 1%~0? 2%，調(diào)pH值為 7. 0 ~7. 4,高溫高壓滅 菌 15_30min。
[0017] (b)將步驟（a)中獲得的發(fā)酵液離心，去除上清液，添加有機(jī)基質(zhì)，獲得含蠟樣芽 孢桿菌的混合物；
[0018] (c)將步驟（b)中的混合物在30°C至50°C下干燥，控制其水分在5%至8%之間， 粉碎后即獲得所述蠟樣芽孢桿菌制劑。
[0019] 優(yōu)選地，所述蠟樣芽孢桿菌制劑的制備方法，其蠟樣芽孢桿菌種子液用所述蠟樣 芽孢桿菌菌種通過多級培養(yǎng)的方式制得。
[0020] 本發(fā)明提供的蠟樣芽孢桿菌應(yīng)用于土霉素污染的豬糞堆肥。
[0021] 優(yōu)選地，本發(fā)明提供的蠟樣芽孢桿菌應(yīng)用于土霉素污染的豬糞堆肥，包括以下步 驟：
[0022] A、取土霉素污染的豬糞，加入碳源和水，控制碳氮比在20至25之間，含水率在 60%至70%之間，添加如權(quán)利要求1所述的蠟樣芽孢桿菌或其活性制劑，使得豬糞混有活 菌數(shù)目不低于l〇6/g;
[0023] B、將經(jīng)步驟A處理的豬糞，在25°C至35°C的條件下堆肥，不少于20天。
[0024] 總體而言，通過本發(fā)明所構(gòu)思的以上技術(shù)方案與現(xiàn)有技術(shù)相比，能夠取得下列有 益效果：
[0025] (1)本發(fā)明選擇土霉素污染豬糞用于土霉素高效降解菌的篩選研究，是基于所篩 得菌株為豬糞中土著菌，相比于現(xiàn)有技術(shù)從土霉素生產(chǎn)藥渣或土壤中篩選菌株而言，對豬 糞生長環(huán)境具有更強(qiáng)的適應(yīng)性，能夠縮短后續(xù)加入豬糞中進(jìn)行堆肥處理的延遲期，更快的 發(fā)揮作用，縮短降解土霉素時間，適合大規(guī)模應(yīng)用，這對工程應(yīng)用具有重要意義；
[0026] (2)本發(fā)明提供的土霉素高效降解菌的篩選，通過選擇抗菌藥物種類及用量，控制 細(xì)菌菌落及真菌菌落生長狀況，從而精確選擇目標(biāo)菌種，防止雜菌干擾，選擇效率高；
[0027] (3)本發(fā)明提供的蠟樣芽孢桿菌制劑，通過選擇適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)基質(zhì)，與蠟樣芽孢桿菌 合適的配比結(jié)合，使得蠟樣芽孢桿菌更加易于保藏，適合環(huán)境下生長更為迅速，降解效率更 商；
[0028] (4)本發(fā)明利用所述蠟樣芽孢桿菌進(jìn)行堆肥，能有效降解抗生素，相對于其他物 理、化學(xué)方法，成本低廉，環(huán)境影響小。
【附圖說明】
[0029] 圖1是蠟樣芽孢桿菌B.cereus0214的形態(tài)特征；
[0030] 圖2是實(shí)施例8豬糞堆肥實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析圖；
[0031] 圖3是實(shí)施例9豬糞堆肥實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析圖；
[0032] 圖4是實(shí)施例10豬糞堆肥實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析圖；
[0033] 圖5是實(shí)施例11豬糞堆肥實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析圖。
【具體實(shí)施方式】
[0034] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實(shí)施例，對 本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并 不用于限定本發(fā)明。此外，下面所描述的本發(fā)明各個實(shí)施方式中所涉及到的技術(shù)特征只要 彼此之間未構(gòu)成沖突就可以相互組合。
[0035] 本發(fā)明提供的蠟樣芽孢桿菌，其特征在于，其分類命名為B.CereUS〇214,于2014 年3月3日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心CCTCC，保藏地址中國武漢大學(xué)，保藏編號為 CCTCCM2014061。
[0036] 經(jīng)鑒定，該菌具有以下特征：
[0037] (1)菌落形態(tài)：菌落近圓形，灰白色，不透明，菌落較大，直徑為5~7mm，邊緣不整 齊呈擴(kuò)展?fàn)?，表面稍有光澤呈白蠟狀，不分泌色素?br>[0038] (2)細(xì)胞形態(tài)：革蘭氏陽性桿菌，桿狀，菌株寬度為1.0~1.2iim，長為3.0~ 5. 0ym，無鞭毛，中生芽孢，孢囊無明顯膨大；
[0039] (3) 16SrRNA鑒定結(jié)果：芽孢桿菌屬；
[0040] (4)生理生化特征：兼性厭氧，酚紅葡萄糖肉湯鑒定實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陽性，改良v-p培 養(yǎng)基鑒定實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陽性，硝酸鹽肉湯鑒定實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陽性，動力_硝酸鹽培養(yǎng)基（A法） 鑒定實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陽性，木糖-明膠