一株分離自豆豉中產(chǎn)蛋白酶的解淀粉芽孢桿菌菌株的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種從傳統(tǒng)豆豉中分離純化的解淀粉 芽孢桿菌菌株，該菌株對于本傳統(tǒng)豆豉工業(yè)實(shí)現(xiàn)科學(xué)化和的純種培養(yǎng)有著重要的意義。
【背景技術(shù)】
[0002] 豆豉距今已有兩千多年歷史，具有很高營養(yǎng)價值和驅(qū)寒健食等功效。過去西方學(xué) 者認(rèn)為，枯草桿菌是一種危害甚大的腐敗菌。我國先民卻能化腐朽為神奇，最先用于食品釀 造，由于細(xì)菌豆豉大都由家庭制作食用，古代文獻(xiàn)少有記載，近代學(xué)者也少有涉獵，反而國 外研宄較多。據(jù)近代研宄枯草桿菌能形成大量淀粉酶和蛋白酶，已在工業(yè)生產(chǎn)上廣泛應(yīng)用。 然而，在我國由于細(xì)菌型豆豉的工業(yè)發(fā)酵沿用傳統(tǒng)自然發(fā)酵方法，一直沒有實(shí)現(xiàn)純種發(fā)酵， 傳統(tǒng)自然發(fā)酵過程中的微生物主要來自于空氣中和器具上的微生物，導(dǎo)致水豆豉產(chǎn)品的質(zhì) 量不穩(wěn)定，產(chǎn)品的運(yùn)輸和保藏也受到限制很難實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)通常情況下，自然環(huán)境中存 在的野生菌株發(fā)酵能力參差不齊、安全性較低；雖然在發(fā)酵過程主要產(chǎn)生有益菌，但在開放 的不可控的發(fā)酵體系中很可能存在一些有害菌，如何避免有害菌污染是一個至關(guān)重要的公 共衛(wèi)生課題。為實(shí)現(xiàn)傳統(tǒng)豆豉的工業(yè)化生產(chǎn)，必須用純種發(fā)酵代替自然發(fā)酵。
[0003] 基于以上原因，對自然發(fā)酵豆豉中有益微生物進(jìn)行分離和鑒定，組合對豆豉品質(zhì) 起到至關(guān)重要的有益微生物，為豆豉工業(yè)化、可控化和標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一株從傳統(tǒng)豆豉中分離純化產(chǎn)蛋白酶的解淀粉芽孢桿菌菌 株，可通過液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)蛋白酶。
[0005] 本發(fā)明的從傳統(tǒng)豆豉中分離純化產(chǎn)蛋白酶的解淀粉芽孢桿菌菌株，其分類命名為 解淀粉芽孢桿菌（AaciyA/s 從傳統(tǒng)豆鼓中分離純化技術(shù)分離獲得， 已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期為2014年12月10日，保藏號為：CCTCCM2014639，保藏地址是中國武漢大學(xué)。
[0006] 本發(fā)明所述的解淀粉芽孢桿菌（ifeci固體培養(yǎng)特征 為： 固體培養(yǎng)為肉湯培養(yǎng)基，37±1°C培養(yǎng)24h，菌落直徑8~12mm。呈白色不透明菌落，表 面粗糙，菌落邊緣不規(guī)則，在多種培養(yǎng)基上均不產(chǎn)色素。
[0007] 本發(fā)明所述的解淀粉芽孢桿菌的顯微形態(tài)特征為： 菌體呈短桿狀，染色均勻，具運(yùn)動性，兼性厭氧，可形成內(nèi)生芽孢，芽孢囊膨大，呈橢圓 形，游離芽孢表面著色弱，革蘭氏染色陽性。
[0008] 本發(fā)明所述的解淀粉芽孢桿菌的液體培養(yǎng)條件為： X：培養(yǎng)基為酪素發(fā)酵培養(yǎng)基，搖瓶培養(yǎng)3天，培養(yǎng)溫度37±1°C，搖床轉(zhuǎn)速為170r/ min〇
[0009] :f發(fā)酵培養(yǎng)特征：培養(yǎng)第1天，發(fā)酵液變渾濁，培養(yǎng)第3天，發(fā)酵液顏色變深，數(shù) 量變多，直徑變大。
[0010] ③解淀粉芽孢桿菌（液體發(fā)酵3天后，對發(fā)酵液進(jìn) 行化學(xué)提取、分離可得到中性蛋白酶。
[0011] 本發(fā)明所述的解淀粉芽孢桿菌菌株的基因登錄號為KP419723，16SrDNA堿基序列 為： GGCAATGGCGGGCGTTCTATAATGCAAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGG ACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGT TGTTTGAACCGCATGGTTCAGACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAG TTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGAC ACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGT GAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCCGTTCAAATAGGGCGGCACCTTG ACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGG AATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCA TTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGA GGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATT AGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAA CGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGG TGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAG GACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTC CCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCG GAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAA AGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGC GTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCG TCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTATGGAGCCAGCCGCCGAAGGTGAACAGAT TG〇
[0012] 本發(fā)明所述的解淀粉芽孢桿菌菌株，經(jīng)發(fā)酵可得中性蛋白酶，其工藝包括菌種活 化、發(fā)酵培養(yǎng)、發(fā)酵產(chǎn)物的相對分子質(zhì)量的測定這三個步驟。
[0013] 其中，菌種活化采用平板培養(yǎng)，培養(yǎng)基為肉湯培養(yǎng)基，培養(yǎng)原料為：牛肉膏0. 3%， 1%蛋白胨，〇. 5%NaCl，pH為7. 0~7. 2 ;培養(yǎng)時間：1天；培養(yǎng)溫度：37±1°C。
[0014] 發(fā)酵培養(yǎng)：發(fā)酵培養(yǎng)基為酪素發(fā)酵培養(yǎng)基；發(fā)酵原料為0. 5%干酪素，0. 1%葡萄糖， 0. 1% 酵母浸粉，0. 4%K2HP04,0 . 05%KH2P04,0. 01%MgS04J§養(yǎng)時間：2 天；培養(yǎng)溫度：37±1°C。
[0015] 發(fā)酵產(chǎn)物的相對分子質(zhì)量的測定：發(fā)酵完畢，轉(zhuǎn)速l〇〇〇〇r/min下離心5min，獲得 粗酶提取液，再進(jìn)行硫酸銨鹽析、脫鹽、真空冷凍干燥后將所得的蛋白酶進(jìn)行SDS-PAGE電 泳用以測定該蛋白酶的相對分子質(zhì)量。
[0016] 本發(fā)明從傳統(tǒng)豆豉中獲得一株生長快、產(chǎn)蛋白酶的解淀粉芽孢桿菌（ 本發(fā)明所述的解淀粉芽抱桿菌通 過菌體液體發(fā)酵能夠產(chǎn)生蛋白酶，該菌株容易培養(yǎng)，生產(chǎn)安全性高，篩選所得菌株液體發(fā)酵 培養(yǎng)酶活達(dá)到148~2231U/mL，遺傳穩(wěn)定性好，其代謝產(chǎn)物蛋白酶容易分離純化，且其代謝 產(chǎn)物蛋白酶的酶活性較高。為傳統(tǒng)豆豉工業(yè)實(shí)現(xiàn)科學(xué)化和的純種培養(yǎng)奠定了基礎(chǔ)。
[0017]
【附圖說明】： 圖1為本發(fā)明所述解淀粉芽孢桿菌的菌落形態(tài)； 圖2為本發(fā)明所述解淀粉芽孢桿菌用番紅和孔雀綠 染色后在100倍顯微鏡下觀察到的芽孢形態(tài)； 圖3為本發(fā)明所述的解淀粉芽孢桿菌革蘭氏染色后 再400倍顯微鏡下觀察到的菌體形態(tài)； 圖4是本發(fā)明所述的菌株Jxnuwy-1依據(jù)16SrDNA序列建立的遺傳進(jìn)化樹示意圖； 圖5為本發(fā)明所述解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)生的蛋白酶的SDS-PAGE電泳圖。
[0018]
【具體實(shí)施方式】： 以下結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行細(xì)說明。
[0019] 實(shí)施例1:本發(fā)明解淀粉芽孢桿菌株的制備或篩選 步