基礎(chǔ)上，該培養(yǎng)添加劑顯著增 加培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞分化后細(xì)胞群體中神經(jīng)元所占的比例神經(jīng)元的比例（45. 9較之于 31. 2% )，而減少星形膠質(zhì)細(xì)胞的比例（22. 3較之于34. 4% )，少枝膠質(zhì)細(xì)胞的比例無(wú)明顯 差異，提示該培養(yǎng)添加劑不但促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增殖，而且更加保護(hù)其干細(xì)胞特性，減弱了在 培養(yǎng)過(guò)程中神經(jīng)干細(xì)胞自發(fā)分化成星形膠質(zhì)細(xì)胞的傾向，這個(gè)特性是培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞所非 常需要的。
【附圖說(shuō)明】
[0041] 圖1為3H_胸腺嘧啶核苷摻入法測(cè)定干細(xì)胞增殖結(jié)果比較圖；數(shù)據(jù)代表平均數(shù)土 標(biāo)準(zhǔn)誤.N= 6 ;結(jié)果顯示本發(fā)明添加劑與N2比較更加促進(jìn)干細(xì)胞增殖，而且統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯 著性差異（林*P〈〇. 001)。
【具體實(shí)施方式】
[0042] 下面結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說(shuō)明；下述實(shí)施例是說(shuō)明性的，不是限定性的， 不能以下述實(shí)施例來(lái)限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0043] 本發(fā)明中所使用的設(shè)備，如無(wú)特殊規(guī)定，均為本領(lǐng)域內(nèi)常用的設(shè)備；本發(fā)明中所使 用的方法，如無(wú)特殊規(guī)定，均為本領(lǐng)域內(nèi)常用的方法。
[0044] 本發(fā)明中所使用的N2添加劑、B27培養(yǎng)添加劑、神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)用的基本培養(yǎng)基 均可以購(gòu)自生物科技（LifeTech)。
[0045] 一種新型神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)添加劑，其組成成分及最終使用濃度為：
[0046] 牛血清白蛋白1毫克/毫升，生物素50毫微克/毫升，左旋肉堿1微克/毫升，乙 醇胺〇. 5微克/毫升，D⑴-半乳糖7. 5微克/毫升，谷胱甘肽0. 1微摩爾和亞硒酸鈉30毫 微摩爾。
[0047] 上述新型神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)添加劑的應(yīng)用可以如下：
[0048] 第一步要做的是配制含有新型簡(jiǎn)化培養(yǎng)添加劑的神經(jīng)干細(xì)胞完全培養(yǎng)基。這一步 應(yīng)用于所有的下述四個(gè)實(shí)施例。所以就不在各實(shí)施例中重復(fù)了。
[0049] 1.首先是按照新型簡(jiǎn)化培養(yǎng)添加劑的配方配制100倍濃縮（100X)的儲(chǔ)存液*，先 將各成分逐個(gè)溶解在細(xì)胞培養(yǎng)級(jí)純的去離子水中，最后溶入白蛋白。用0. 22微米無(wú)菌濾器 過(guò)濾后分裝在5毫升的凍存管里，在-20 °C保存。每次使用之前在37 °C水浴溶解。
[0050] *注：上述新型簡(jiǎn)化培養(yǎng)添加劑的組成成分及最終使用濃度為：
[0051] 牛血清白蛋白1毫克/毫升，生物素50毫微克/毫升，左旋肉堿1微克/毫升，乙 醇胺〇. 5微克/毫升，D⑴-半乳糖7. 5微克/毫升，谷胱甘肽0. 1微摩爾和亞硒酸鈉30毫 微摩爾。
[0052] 2.配制含有新型簡(jiǎn)化培養(yǎng)添加劑的神經(jīng)干細(xì)胞完全培養(yǎng)基：向DMEM和DMEM/F 12 (體積比1:1)合成培養(yǎng)基中依次混入濃縮N2添加劑（體積比1:100稀釋?zhuān)瑵饪s新型簡(jiǎn) 化培養(yǎng)添加劑（體積比1:100稀釋?zhuān)?0毫微克/毫升堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（FGF)和 20暈微克/毫升表皮生長(zhǎng)因子（EGF)。
[0053] 所以含有上述新型神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)添加劑的培養(yǎng)基，其組成成分及比例如下：
[0054]DMHM培養(yǎng)基和DMEM/F12培養(yǎng)基的合成培養(yǎng)基，其中DMHM和DMEM/F12的體積比 為 1:1 ;
[0055]N2培養(yǎng)添加劑（稀釋1:100)，N2培養(yǎng)添加劑的成分和使用濃度：0. 025毫克/毫 升胰島素，〇. 1毫克/毫升轉(zhuǎn)鐵蛋白，20微摩爾孕酮，100微摩爾腐胺和30毫微摩爾亞硒酸 鈉；
[0056] 10暈微克/毫升堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子和20暈微克/毫升表皮生長(zhǎng)因子；
[0057] 以及上述新型神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)添加劑。
[0058] 實(shí)施例1
[0059] 培養(yǎng)人胚胎來(lái)源的大腦和脊髓神經(jīng)干細(xì)胞和神經(jīng)前體（母）細(xì)胞。
[0060] 1)經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的檢驗(yàn)篩選排除常見(jiàn)的傳染病和獲得孕婦的書(shū)面許可之后，獲取人工 流產(chǎn)來(lái)源的妊娠8-10周之間的胚胎，在解剖顯微鏡下解剖取材大腦皮質(zhì)和脊髓組織。
[0061] 2)DMEM洗滌神經(jīng)組織3次，在10單位/毫升木瓜蛋白酶加4毫克/毫升DNA酶溶 液中，37°C消化45分鐘。
[0062] 3)加入4毫克/毫升DNA酶后用吸管輕輕地吹打5-7次以分散組織；
[0063] 4)在1000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，再懸浮于無(wú)鈣鎂的Hanks平衡鹽溶液（HBSS)中 清洗。重復(fù)三次后，將制成的單細(xì)胞懸液經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色后用血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀測(cè)定細(xì)胞密度；
[0064] 5)按5X104/平方厘米的密度將細(xì)胞懸浮在含有新型簡(jiǎn)化培養(yǎng)添加劑的神經(jīng)干細(xì) 胞完全培養(yǎng)基中，接種于多孔培養(yǎng)板或培養(yǎng)瓶中。細(xì)胞培養(yǎng)容器都事先涂覆過(guò)15毫微克/ 毫升多聚鳥(niǎo)氨酸，然后是3毫微克/毫升的纖維連接蛋白。在37°C，5%C02水套式二氧化 碳培養(yǎng)箱里培養(yǎng)；
[0065] 6)每?jī)商熳骺偭克姆种囵B(yǎng)基的換液，直至細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)培養(yǎng)板時(shí)，即可用來(lái)進(jìn)行 各種實(shí)驗(yàn)或者消化之后再一次傳代培養(yǎng)或者進(jìn)行低溫儲(chǔ)存。
[0066] 實(shí)施例2
[0067] 器官培養(yǎng)（又名組織培養(yǎng)）成年人脊髓組織中神經(jīng)干細(xì)胞和神經(jīng)前體（母）細(xì)胞
[0068] 1)排除常見(jiàn)的傳染病之后獲得死者家屬的書(shū)面許可之后，解剖取材供體脊髓，橫 切斷脊髓為2-3mm厚，然后進(jìn)一步解剖顯微鏡下將神經(jīng)組織切成2-3立方毫米的組織塊。
[0069] 2)加PBS清洗三次之后加入含有新型簡(jiǎn)化培養(yǎng)添加劑的神經(jīng)干細(xì)胞完全培養(yǎng)基。 轉(zhuǎn)移到未涂覆的塑料平皿中，在37°C，5% 0)2水套式二氧化碳培養(yǎng)箱里培養(yǎng)7天，即可以經(jīng) 過(guò)木瓜蛋白酶消化、吹打分散、以制備貼壁分散細(xì)胞培養(yǎng)。也可以直接用福爾馬林固定，切 片之后作免疫組織化學(xué)染色研宄，
[0070] 實(shí)施例3
[0071] 所有胚胎和成年來(lái)源的哺乳動(dòng)物神經(jīng)干細(xì)胞和神經(jīng)前體（母）細(xì)胞的傳代分散細(xì) 胞培養(yǎng)。
[0072] 1)無(wú)鈣鎂的Hanks平衡鹽溶液（HBSS)洗分散細(xì)胞培養(yǎng)3次之后，在10單位/毫 升木瓜蛋白酶加4毫克/毫升DNA酶溶液中，37°C消化10分鐘；
[0073] 2)加入4毫克/毫升DNA酶后用吸管輕輕地吹打5-7次以分散組織；
[0074] 3)在1000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，再懸浮于無(wú)鈣鎂的Hanks平衡鹽溶液（HBSS)中 清洗。重復(fù)三次后，將制成的單細(xì)胞懸液經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色后用血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀測(cè)定細(xì)胞密度；
[0075] 4)按5X104/平方厘米的密度將細(xì)胞懸浮在含有新型簡(jiǎn)化培養(yǎng)添加劑的神經(jīng)干細(xì) 胞完全培養(yǎng)基中，接種于多孔培養(yǎng)板或培養(yǎng)瓶中。細(xì)胞培養(yǎng)容器都事先涂覆過(guò)15毫微克/ 毫升多聚鳥(niǎo)氨酸，然后是3毫微克/毫升的纖維連接蛋白。在37°C，5%C02水套式二氧化 碳培養(yǎng)箱里培養(yǎng)；
[0076] 5)每?jī)商熳骺偭克姆种囵B(yǎng)基的換液，直至細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)培養(yǎng)板時(shí)，即可用來(lái)進(jìn)行 各種實(shí)驗(yàn)或者消化之后再一次傳代培養(yǎng)或者進(jìn)行低溫儲(chǔ)存。
[0077] 本發(fā)明新型神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)添加劑的相關(guān)篩選方法和檢測(cè)結(jié)果與驗(yàn)證：
[0078] 本申請(qǐng)人先根據(jù)對(duì)B27成分的分析，挑選B27中成分組成一個(gè)簡(jiǎn)化培養(yǎng)添加劑配 方，該配方的最終使用濃度含有牛血清白蛋白1毫克/毫升，生物素50毫微克/毫升，左旋 肉堿1微克/毫升，乙醇胺〇. 5微克/毫升，D(+)-半乳糖7. 5微克/毫升，谷胱甘肽0. 1微 摩爾和亞硒酸鈉30毫微摩爾。然后在基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上比較該簡(jiǎn)化培養(yǎng)添加劑和B27 培養(yǎng)添加劑對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞生長(zhǎng)的促進(jìn)作用。之后再在簡(jiǎn)化培養(yǎng)添加劑的基礎(chǔ)上逐個(gè)加入其 它B27中成分以測(cè)定其是否有添加效果。
[0079] *注：基本培養(yǎng)基的組成是DMEM和DMEM/F12 (質(zhì)量比為1:1)合成培養(yǎng)基加N2添 加劑（毫升1: 1〇〇稀釋*)和10暈微克/毫升堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（FGF)和20暈微 克/毫升表皮生長(zhǎng)因子（EGF)(都來(lái)自生命科學(xué)公司）
[0080] *注：N2培養(yǎng)添加劑的成分和使用濃度：0. 025暈克/毫升胰島素，0. 1暈克/毫升 轉(zhuǎn)鐵蛋白，20微摩爾孕酮，100微摩爾腐胺，和30毫微摩爾亞硒酸鈉。
[0081] 一、細(xì)胞培養(yǎng)：
[0082] 1)解剖取材妊娠12. 5天和13. 5之間胚胎小鼠的大腦皮質(zhì)（el2. 5-13. 5);
[0083] 2)DMEM洗滌培養(yǎng)后神經(jīng)組織一次，在10單位/毫升木瓜蛋白酶和4毫克/毫升 DNA酶溶液中，37°C消化45分鐘；
[0084] 3)加入4毫克/毫升DNA酶后用吸管輕輕地吹打5-7次以分散組織；
[0085] 4)在1000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，再懸浮于無(wú)鈣鎂的Hanks平衡鹽溶液（HBSS)中 清洗。重復(fù)三次后，將制成的單細(xì)胞懸液經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色后用血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀測(cè)定細(xì)胞密度；
[0086] 5)按5X104/平方厘米的密度將細(xì)胞懸浮在含有新型簡(jiǎn)化培養(yǎng)添加劑的神經(jīng)干細(xì) 胞完全培養(yǎng)基中，接種于24孔培養(yǎng)板中。細(xì)胞培養(yǎng)板先涂覆過(guò)15毫微克/毫升多聚鳥(niǎo)氨 酸，然后是3毫微克/毫升的纖維連接蛋白。在37°C，5%C02水套式二氧化碳培養(yǎng)箱里培 養(yǎng)；
[0087] 6)每?jī)商熳骺偭克姆种囵B(yǎng)基的換液，直至細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)培養(yǎng)板時(shí)，一般需要6-7 天，即可用來(lái)進(jìn)行3h-胸腺嘧啶核苷摻入法來(lái)測(cè)定小鼠神經(jīng)干細(xì)胞增殖的測(cè)定。
[0088] 7)為了用免疫細(xì)胞化學(xué)染色來(lái)決定培養(yǎng)中各種分化后細(xì)胞所占的比例，需要在細(xì) 胞長(zhǎng)滿(mǎn)培養(yǎng)板時(shí)全部換用新鮮培養(yǎng)基并撤除