雜交瘤細(xì)胞株McAb 1H2及兔出血癥RHDVa型病毒單克隆抗體的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一株雜交瘤細(xì)胞株及其分泌的單克隆抗體。
【背景技術(shù)】
[0002]兔出血癥(RabbitHemorrhagic Disease, RHD)，俗稱“兔瘟”(Rabbit Plague)，是由兔出血癥病毒(Rabbit Hemorrhagic Disease Virus, RHDV)引起的急性、烈性、接觸性傳染病，以肝壞死、實(shí)質(zhì)臟器水腫、呼吸系統(tǒng)及全身多器官淤血及出血性變化為主要特征，對養(yǎng)兔業(yè)通常造成毀滅性的打擊。
[0003]2013 年 Ghislaine Le Gall_Recul6 等人報(bào)道了有 RHDV2 型病毒的出現(xiàn)，RHDV 2型病毒與RHDVa型病毒核衣殼蛋白基因序列的同源性為82.4%，氨基酸序列的同源性為89.2%。這兩株病毒的免疫交叉保護(hù)率為75%。VP60基因是病毒唯一的衣殼蛋白編碼基因，在RHDVa型病毒中VP60基因的同源性在93.7%?99.8%之間；在RHDV2型病毒中VP60基因的同源性為98.5%。由于RHDV 2型病毒與RHDVa型病毒VP60蛋白氨基酸序列的同源性為89.2%，兩者相似的抗原位點(diǎn)多。所以，目前還未有能夠單獨(dú)識別RHDV2型病毒或RHDVa型病毒的單克隆抗體。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明是為了解決目前沒有能夠單獨(dú)識別RHDV2型病毒或RHDVa型病毒的單克隆抗體的問題，而提供的雜交瘤細(xì)胞株McAb 1H2及兔出血癥RHDVa型病毒單克隆抗體。
[0005]本發(fā)明雜交瘤細(xì)胞株McAb 1H2為小鼠雜交瘤細(xì)胞(Mus musculus Hybridoma)McAb 1H2，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCCN0.10317ο
[0006]本發(fā)明兔出血癥RHDVa型病毒的單克隆抗體，由保藏號為CGMCC N0.10317的雜交瘤細(xì)胞株McAb 1Η2產(chǎn)生。
[0007]本發(fā)明雜交瘤細(xì)胞株McAb 1Η2分泌的兔出血癥RHDVa型病毒的單克隆抗體可以單獨(dú)識別RHDVa型病毒和VP60a蛋白；該單克隆抗體分子重鏈為IgGl亞型，輕鏈為Kappa亞型(如圖1所示)。
[0008]利用本發(fā)明兔出血癥RHDVa型病毒的單克隆抗體可以準(zhǔn)確的鑒別出患有兔出血癥的兔子具體感染的是否為RHDVa型病毒，能夠更有針對性的采取措施，對后期的免疫和防治具有深遠(yuǎn)的意義。
[0009]雜交瘤細(xì)胞株McAb 1H2為小鼠雜交瘤細(xì)胞McAb 1H2，屬于小鼠屬(Mus)，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，保藏號為CGMCC N0.10317，保藏日期為2015年I月21日。
【附圖說明】
[0010]圖1是雜交瘤細(xì)胞株McAb 1H2分泌的兔出血癥RHDVa型病毒的單克隆抗體分子亞型鑒定結(jié)果圖。
[0011]圖2是雜交瘤細(xì)胞株McAb 1G2分泌的兔出血癥RHDV2型病毒的單克隆抗體分子亞型鑒定結(jié)果圖。
[0012]圖3是雜交瘤細(xì)胞株McAb 1H2所分泌的抗體分子的ELISA鑒定結(jié)果圖，圖3中a為RHDVa病毒粒子；b為重組Bac_VP60a蛋白；c為重組Bac_VP602蛋白。
[0013]圖4是雜交瘤細(xì)胞株McAb 1G2所分泌的抗體分子的ELISA鑒定結(jié)果圖，圖4中a為RHDVa病毒粒子；b為重組Bac_VP60a蛋白；c為重組Bac_VP602蛋白。
[0014]圖5是雜交瘤細(xì)胞株McAb 1H2所分泌的抗體分子的Western blot鑒定結(jié)果圖，圖5中M為蛋白質(zhì)分子量marker ；b為重組Bac_VP60a蛋白；c為重組Bac_VP602蛋白。
[0015]圖6是雜交瘤細(xì)胞株McAb 1G2所分泌的抗體分子的Western blot鑒定結(jié)果圖，圖6中M為蛋白質(zhì)分子量marker ;b為重組Bac_VP60a蛋白；c為重組Bac_VP602蛋白。
[0016]圖7是雜交瘤細(xì)胞株McAb 1H2所分泌的抗體分子的IFA鑒定結(jié)果圖，圖7中b為rBacmid-VP60a 感染的 Sf9 細(xì)胞；c 為 rBacmid_VP602 感染的 Sf9 細(xì)胞。
[0017]圖8是雜交瘤細(xì)胞株McAb 1G2所分泌的抗體分子的IFA鑒定結(jié)果圖，圖8中b為rBacmid-VP60a 感染的 Sf9 細(xì)胞；c 為 rBacmid_VP602 感染的 Sf9 細(xì)胞。
【具體實(shí)施方式】
[0018]本發(fā)明技術(shù)方案不局限于以下所列舉【具體實(shí)施方式】，還包括各【具體實(shí)施方式】間的任意組合。
[0019]【具體實(shí)施方式】一:本實(shí)施方式雜交瘤細(xì)胞株McAb 1H2為小鼠雜交瘤細(xì)胞(Musmusculus Hybridoma)McAb 1H2，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC N0.10317，保藏日期為2015年I月21日。
[0020]【具體實(shí)施方式】二:本實(shí)施方式兔出血癥RHDVa型病毒的單克隆抗體，由保藏號為CGMCC N0.10317的雜交瘤細(xì)胞株McAb 1H2產(chǎn)生。
[0021]實(shí)施例1
[0022]1.1制備檢測抗原
[0023]將RHDVa-VP60 基因(GenBank access1n number:JF412629)和 RHDV2-VP60 基因(GenBank access1n number:HE800532)分別克隆到 pFastBacHTa 載體中，獲得重組質(zhì)粒pfast_VP60a和pfast_VP602，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DHlOBac感受態(tài)細(xì)胞。接種到LB瓊脂平板(含卡那霉素50mg/mL、慶大霉素40mg/mL、四環(huán)素50mg/mL、X_gal 50mg/mL和IPTG142.811^/1^)，37°0培養(yǎng)4811左右。挑取白色菌落，在LB瓊脂平板(含卡那霉素50mg/mL、慶大霉素 40mg/mL、四環(huán)素 50mg/mL、X_gal 50mg/mL 和 IPTG 142.8mg/mL)上再次劃線培養(yǎng)，菌落進(jìn)一步確定為白色者接種于LB培養(yǎng)基(該LB培養(yǎng)基含卡那霉素50mg/mL、慶大霉素40mg/mL和四環(huán)素50mg/mL)，37°C搖震培養(yǎng)24?36h。提取Bacmid為模板，以通用引物M13(+)和M13(-)PCR擴(kuò)增長度約為4.2kb的片段、以引物M13 (+)和VP60下游引物PCR擴(kuò)增長度約為4.0kb的片段。選擇擴(kuò)增片段符合預(yù)期大小、特異性良好的重組Bacmid，命名為rBacmid-VP60a和 rBacmid_VP602o
[0024]用rBacmid_VP60a 和 rBacmid_VP602 感染 Sf9 (SpAoptera frugiperda)細(xì)胞，合成特異性的重組Bac-VP60a和Bac_VP602蛋白。并以重組Bac_VP60a和Bac_VP602蛋白作為單克隆抗體的檢測抗原。
[0025]1.2單克隆抗體制備
[0026]1.2.1免疫小鼠實(shí)驗(yàn)
[0027]將純化后的重組蛋白Bac_VP60a和重組蛋白Bac_VP602用無菌PBS培養(yǎng)基稀釋至500 μ g/mL，加入等量的氟氏完全佐劑乳化后，選擇6?8周齡BALB/c雌性小鼠腹腔及背部皮下多點(diǎn)注射，劑量0.4mL/只；第7d、21d分別進(jìn)行第二次、第三次免疫，抗原用等量氟氏不完全佐劑乳化；第35d尾靜脈注射無佐劑抗原80 μ g，三天后斷尾采血測定血清ELISA效價，選取效價較高的小鼠無菌取脾臟進(jìn)行融合。
[0028]1.2.2 SP2/0 細(xì)胞準(zhǔn)備
[0029]融合前2周復(fù)蘇SP2/0骨髓瘤細(xì)胞，進(jìn)行傳代培養(yǎng)，待細(xì)胞生長狀態(tài)穩(wěn)定后，將骨髓瘤細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)，觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，選擇分布均勻、大小均一、生長旺盛的細(xì)胞進(jìn)行融合。融合當(dāng)天，用吸管吸取無血清DMEM培養(yǎng)基將細(xì)胞從瓶壁吹下，收集于離心管中，100r/min離心5min，棄上清，用無血清DMEM將骨髓瘤細(xì)胞懸浮，臺盼藍(lán)計(jì)數(shù)備用。
[0030]1.2.3飼養(yǎng)層細(xì)胞制備
[0031]將加強(qiáng)免疫后的BALB/c小鼠摘除眼球放血后斷頸椎處死，浸泡于75%酒精消毒3?5min。用無菌剪刀剪開皮膚，暴露腹膜。用無菌注射器向腹腔內(nèi)注入6?8mL無血清DMEM培養(yǎng)液，反復(fù)沖洗3?4次并吸出培養(yǎng)液，放入1mL離心管，1200r/min離心5?6min。含10%優(yōu)級胎牛血清培養(yǎng)液混懸，調(diào)整細(xì)胞數(shù)IX 105個/mL后分裝96孔板，100 μ L/孔，置含5% C02的37°C恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。一般飼養(yǎng)細(xì)胞在融合前一天制備，一只小鼠可獲得5 X 106?8 X 106個腹腔巨噬細(xì)胞，若用小鼠胸腺細(xì)胞作為飼養(yǎng)細(xì)胞時，細(xì)胞濃度為5 X 106個/mL，小鼠脾細(xì)胞為I X 106個/mL,小鼠的成纖維細(xì)胞I X 105個/mL，均為100 μ L/孔。
[0032]1.2.4免疫脾細(xì)胞
[0033]脾細(xì)胞懸液的制備程序如下:取加強(qiáng)免疫后的BALB/c小鼠，摘除眼球采血分離血清后作為抗體檢測的陽性對照。通過拉頸脫位致死小鼠，浸泡于75%酒精中消毒3?5min，于解剖臺上固定后用無菌剪刀剪開腹部左側(cè)皮膚，剪開腹膜，暴露脾臟。將脾臟用無菌剪刀取出后置于盛有1mL不完全培養(yǎng)基的平皿中，剪除周圍結(jié)締組織，輕輕洗滌，置200目銅網(wǎng)上用注射器針芯研磨成細(xì)胞懸液后計(jì)數(shù)。一般免疫后脾臟體積約是正常鼠脾臟體積的2倍，細(xì)胞數(shù)為2X10