8個左右。將收獲的脾細(xì)胞懸液1000r/min離心5min，棄上清，備用。
[0034]1.2.5細(xì)胞融合
[0035]無菌采取免疫小鼠脾臟，脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞分別計數(shù)、離心后以不完全培養(yǎng)基重懸，脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞數(shù)目以5:1比例加入50mL離心管內(nèi)，混勻，室溫1000r/min離心5min，棄去不完全培養(yǎng)基后輕拍離心管使細(xì)胞均勻貼附于管底，37°C水浴條件下在60s內(nèi)緩慢滴加濃度為50%的PEG3350溶液lmL，此過程中輕輕轉(zhuǎn)動離心管；PEG3350滴加完畢后靜置離心管30s使細(xì)胞充分融合，然后由慢到快在2min內(nèi)逐滴加入37°C預(yù)熱的不完全培養(yǎng)液20mL終止融合；室溫800r/min離心8min棄上清，適量37°C預(yù)熱含HAT完全選擇培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，加入到預(yù)先制備的含飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)。分別于融合后第3、7d用HAT選擇培養(yǎng)基半量換液，第1d后改用HT培養(yǎng)基。待細(xì)胞集落體積達(dá)到1/3培養(yǎng)孔，取上清液用間接ELISA進(jìn)行抗體檢測。
[0036]1.2.6間接ELISA檢測方法建立:
[0037](I)包被:重組Bac_VP60a和Bac_VP602蛋白用pH9.6CBS緩沖液稀釋后，每孔200 μ g，包被酶標(biāo)板，4°C過夜；
[0038](2)洗滌:以PBST (0.01M、ρΗ7.4的PBS緩沖液加入0.05 %的吐溫20)作為洗滌液，將酶標(biāo)板洗滌四次，每次間隔浸泡3min，扣干；
[0039](3)封閉:8% (w/v)的脫脂乳PBST溶液，250 μ L/孔，37°C封閉2h,同上洗滌、扣干；
[0040](4)檢測:加入雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)物上清液，100 μ L/孔，37°C作用60min后洗滌、扣干；
[0041](5)加入1:30000稀釋的羊抗兔辣根過氧化物酶標(biāo)記IgG，100 μ L/孔，37°C作用Ih后洗滌、扣干；
[0042](6)顯色:加TMB底物100 μ L/孔，37°C避光顯色15min ；
[0043](7)終止:酶標(biāo)板加入2M的H2S04 50 μ L/孔終止顯色，酶標(biāo)儀讀取0D490。
[0044]以重組蛋白VP60a作為免疫原制備的雜交瘤細(xì)胞株，針對重組Bac_VP60a蛋白作為檢測抗原檢測結(jié)果0D490值多2.0且對以重組蛋白Bac-VP602作為檢測抗原的檢測結(jié)果0D490值等同于陰性對照孔0D490值(約0.2)時，該雜交瘤細(xì)胞株作為單獨(dú)識別RHDVa病毒的待選樣品，進(jìn)行下一步的亞克隆和篩選。以重組蛋白VP602作為免疫原制備的雜交瘤細(xì)胞株，針對重組Bac-VP602蛋白作為檢測抗原檢測結(jié)果0D490值多2.0且對以重組蛋白Bac-VP60a作為檢測抗原的檢測結(jié)果0D490值等同于陰性對照孔0D490值(約0.2)時，該雜交瘤細(xì)胞株作為單獨(dú)識別RHDV2型病毒的待選樣品，進(jìn)行下一步的亞克隆和篩選。
[0045]1.2.7雜交瘤細(xì)胞篩選及克隆
[0046]當(dāng)細(xì)胞集落體積長至1/3培養(yǎng)孔(1d左右)的時候，用間接ELISA檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清，篩選分泌陽性抗體的雜交瘤細(xì)胞，每孔重復(fù)檢測三次。有限稀釋法將所得陽性雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行三次亞克隆，有限稀釋法進(jìn)行亞克隆，程序如下:
[0047](I)制備飼養(yǎng)細(xì)胞懸液(同融合前)。
[0048](2)陽性孔細(xì)胞的計數(shù)并調(diào)整細(xì)胞數(shù)在I X 103?5X 103個/mL。
[0049](3)取130個細(xì)胞放入6.5mL含飼養(yǎng)細(xì)胞完全培養(yǎng)液，即20個/mL，100 μ L/孔加A、B、C三排為每孔2個細(xì)胞。余下2.9mL細(xì)胞懸液補(bǔ)加2.9mL含飼養(yǎng)細(xì)胞的完全培養(yǎng)液，細(xì)胞數(shù)為10個/mL，100 μ L/孔加D、E、F三排，為每孔I個細(xì)胞。余下2.2mL細(xì)胞懸液補(bǔ)加2.2mL含飼養(yǎng)細(xì)胞的完全培養(yǎng)液，細(xì)胞數(shù)5個/mL，100 μ L/孔，加G、H兩排，為每孔0.5個細(xì)胞。
[0050](4)培養(yǎng)4?5d后，在倒置顯微鏡上可見到小的細(xì)胞克隆，補(bǔ)加完全培養(yǎng)液100 μ L/ 孔。
[0051](5)第8?9d時，肉眼可見細(xì)胞克隆(細(xì)胞集落體積長至1/3培養(yǎng)孔)，及時進(jìn)行抗體檢測。初次克隆化的雜交瘤細(xì)胞需要在完全培養(yǎng)液中加HAT。
[0052](6)按照上述方法連續(xù)克隆3次以上，直到所有的克隆細(xì)胞孔都為陽性。
[0053]能夠穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，擴(kuò)大培養(yǎng)后液氮凍存。
[0054]1.2.8雜交瘤細(xì)胞分泌的抗體分子的Western blot鑒定
[0055]將Bac_VP60a蛋白和和Bac_VP602蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)膜，以雜交瘤細(xì)胞株的培養(yǎng)上清作為第一抗體，以HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG作為第二抗體，DAB底物顯色。
[0056]1.2.9雜交瘤細(xì)胞分泌的抗體分子的IFA鑒定
[0057]用rBacmid-VP60a和rBacmid_VP602感染Sf9細(xì)胞72h，棄細(xì)胞培養(yǎng)液，經(jīng)多聚甲醛固定后，加入雜交瘤細(xì)胞株的培養(yǎng)上清作為第一抗體，以FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG作為第二抗體，通過488nm波長熒光顯微鏡觀察。
[0058]1.2.10雜交瘤細(xì)胞分泌的抗體分子的亞型鑒定
[0059]小鼠單克隆抗體亞型鑒定試劑盒購自北京義翹神州生物技術(shù)公司，按照說明書對雜交瘤細(xì)胞株分泌的抗體分子亞型進(jìn)行鑒定。
[0060]經(jīng)連續(xù)3次克隆，獲得能夠分泌抗體分子并單獨(dú)識別RHDVa型病毒的雜交瘤細(xì)胞株小鼠雜交瘤細(xì)胞(Mus musculus Hybridoma)McAb 1H2，該雜交瘤細(xì)胞株分泌的抗體分子可以識別RHDVa病毒粒子和重組Bac_VP60a蛋白，不識別Bac_VP602蛋白，差異極顯著(P〈0.01)，如圖3所示。獲得能夠分泌抗體分子并單獨(dú)識別RHDV2的雜交瘤細(xì)胞株小鼠雜交瘤細(xì)胞(Mus musculus Hybridoma) McAb 1G2，該雜交瘤細(xì)胞株分泌的抗體分子不能夠識別RHDVa病毒粒子和重組Bac-VP60a蛋白，僅識別Bac_VP602蛋白，差異極顯著(P〈0.01)，如圖4所示。
[0061]雜交瘤細(xì)胞株小鼠雜交瘤細(xì)胞(Mus musculus Hybridoma)McAb 1H2分泌的抗體分子可以識別重組Bac_VP60a蛋白，在70kDa處有特異條帶，不識別Bac_VP602蛋白，無條帶，如圖5所示。雜交瘤細(xì)胞株小鼠雜交瘤細(xì)胞(Mus musculus Hybridoma)McAb 1G2分泌的抗體分子不能夠識別重組Bac_VP60a蛋白，僅識別Bac_VP602蛋白，在70kDa處有特異條帶，如圖6所示。
[0062]雜交瘤細(xì)胞株小鼠雜交瘤細(xì)胞(Mus musculus Hybridoma)McAb 1H2分泌的抗體分子可以識別rBacmid-VP60a感染的Sf9細(xì)胞，不識別rBacmid_VP602感染的Sf9細(xì)胞(如圖7所示)。雜交瘤細(xì)胞株小鼠雜交瘤細(xì)胞(Mus musculus Hybridoma)McAb 1G2分泌的抗體分子不能夠識別rBacmid-VP60a感染的Sf9細(xì)胞，僅識別rBacmid_VP602感染的Sf9細(xì)胞(如圖8所示)。
[0063]本發(fā)明雜交瘤細(xì)胞株McAb 1G2分泌的兔出血癥RHDV2型病毒的單克隆抗體可以單獨(dú)識別RHDV2型病毒和VP602蛋白；該單克隆抗體分子重鏈為IgG2a亞型，輕鏈為Kappa亞型(如圖2所示)。
[0064]而雜交瘤細(xì)胞株McAb 1H2分泌的兔出血癥RHDVa型病毒的單克隆抗體可以單獨(dú)識別RHDVa型病毒和VP60a蛋白；該單克隆抗體分子重鏈為IgGl亞型，輕鏈為Kappa亞型(如圖1所示)。
[0065]實驗證明利用本發(fā)明兔出血癥RHDV2型病毒的單克隆抗體可以準(zhǔn)確的鑒別出患有兔出血癥的兔子具體感染的是否為RHDV2型病毒。
【主權(quán)項】
1.雜交瘤細(xì)胞株McAb1G2，其特征在于其為小鼠雜交瘤細(xì)胞(Mus musculusHybridoma)McAb 1G2，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC N0.10316ο
2.兔出血癥RHDV2的單克隆抗體，其特征在于兔出血癥RHDV2型病毒的單克隆抗體，由保藏號為CGMCC N0.10316的雜交瘤細(xì)胞株McAb 1G2產(chǎn)生。
【專利摘要】雜交瘤細(xì)胞株McAb 1G2及兔出血癥RHDV2型病毒單克隆抗體，它涉及一株雜交瘤細(xì)胞株及其分泌的單克隆抗體。它解決了目前沒有能夠單獨(dú)識別RHDV2型病毒或RHDVa型病毒的單克隆抗體的問題。雜交瘤細(xì)胞株McAb 1G2保藏號為CGMCC No.10316。兔出血癥RHDV2型病毒的單克隆抗體，由保藏號為CGMCC No.10316的雜交瘤細(xì)胞株McAb 1G2產(chǎn)生。利用本發(fā)明兔出血癥RHDV2型病毒的單克隆抗體可以準(zhǔn)確的鑒別出患有兔出血癥的兔子具體感染的是否為RHDV2型病毒，能夠更有針對性的采取措施，對后期的免疫和防治具有深遠(yuǎn)的意義。CGMCC No.1031620150121
【IPC分類】C12N5-20, C07K16-10
【公開號】CN104694482
【申請?zhí)枴緾N201510149267
【發(fā)明人】劉家森, 曲連東, 姜騫, 郭東春, 劉大飛, 劉春國, 李志杰, 仇錚, 田進(jìn), 吳紅霞, 劉明
【申請人】中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所
【公開日】2015年6月10日
【申請日】2015年4月1日