基因在增強(qiáng)植物抗旱性中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及一種GhEXLB2基因在增強(qiáng)植物抗 旱性中的應(yīng)用。從棉花中克隆得到一種細(xì)胞壁蛋白基因GhEXLB2,功能驗(yàn)證表明超表達(dá) GhEXLB 2基因能提高棉花對(duì)干旱的耐受性。利用本發(fā)明克隆的GhEXLB 2基因，通過遺傳轉(zhuǎn)化 可應(yīng)用于增強(qiáng)植物對(duì)干旱的耐受性。
【背景技術(shù)】
[0002] 干旱是影響作物生長(zhǎng)、限制作物產(chǎn)量的主要非生物脅迫因子。據(jù)統(tǒng)計(jì)，世界干旱、 半干旱地區(qū)占地球陸地面積的三分之一（Salekdeh et al. 2009)。我國(guó)干旱、半干旱地區(qū)占 全國(guó)陸地面積的二分之一，干旱天氣頻繁出現(xiàn)，給我國(guó)作物生產(chǎn)帶來極大的影響。
[0003] 抗旱性是一個(gè)由多基因控制的復(fù)雜性狀，涉及多種抗旱機(jī)制和信號(hào)傳導(dǎo)途徑。植 物在遇到干旱脅迫后，植物細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理生化、代謝、基因表達(dá)等許多方面都產(chǎn)生 一系列變化，以最大限度地減輕逆境造成的傷害（Bray 2007)。近些年來，通過同源發(fā)掘、基 因克隆和遺傳轉(zhuǎn)化等方法發(fā)掘并驗(yàn)證了一些參與植物干旱脅迫響應(yīng)相關(guān)的基因，根據(jù)基因 蛋白產(chǎn)物功能的不同，將這些基因主要分為兩大類（Shinozaki and Yamaguchi-Shinozaki 2007):-類是編碼功能蛋白的基因，如滲透壓調(diào)節(jié)物質(zhì)（脯氨酸、甜菜堿、海藻糖等）合成 代謝過程中的一些酶、過氧化物酶、糖和脯氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等，這些基因的產(chǎn)物可以直接保護(hù) 植物組織細(xì)胞，使其免于外界脅迫環(huán)境造成的傷害（裴金玲et al. 2012)。另一類是調(diào)控蛋 白基因，包括轉(zhuǎn)錄因子及感受和傳導(dǎo)脅迫信號(hào)的蛋白激酶及其參與的信號(hào)路徑中的效應(yīng)基 因等，這類基因主要通過復(fù)雜的表達(dá)調(diào)控去調(diào)節(jié)下游保護(hù)性功能基因表達(dá)來實(shí)現(xiàn)植物對(duì)逆 境的抵抗（Zhu 2002)。
[0004] 膨脹素（EXPs)是一種細(xì)胞壁松弛蛋白，其主要作用方式是疏松植物細(xì)胞壁的組 分，增加細(xì)胞壁的柔韌性（Cosgrove 2000)。編碼EXPs的基因是一個(gè)多基因的家族，依據(jù)結(jié) 構(gòu)分為四個(gè)亞家族：兩個(gè)膨脹素亞家族a_expansin(EXPAs)和P-expansin(EXPBs);兩個(gè) 類膨脹素亞家族e(cuò)xpansin-like A(EXLA)和expansin like B(EXLB)(Kende et al.2004)。 不同家族的膨脹素蛋白之間只有20% -40%的相似性。早期的研究表明，EXP四個(gè)亞家族 中，EXPA和EXPB亞家族的多數(shù)成員在體外都具有使細(xì)胞伸長(zhǎng)的活性，EXPA主要存在于雙子 葉和非禾本科單子葉植物中；EXPB主要存在禾本科單子葉植物中（Yennawar et al.2006)。
[0005] 近年來的研究發(fā)現(xiàn)膨脹素除了參與植物生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控，還對(duì)植物抗非生物逆境 有重要作用。在玉米中的研究表明，干旱脅迫條件下EXPs在維持生長(zhǎng)過程中起著重要作 用，其主要通過促使細(xì)胞壁更好的擴(kuò)展來維持玉米初生根生長(zhǎng)（Veselov et al. 2008);干 旱條件下水稻根尖和側(cè)根的快速生長(zhǎng)主要是由于0sEXP2基因的表達(dá)（Yang et al. 2004); Li等（Li et al.2015)發(fā)現(xiàn)水分脅迫能夠誘導(dǎo)小麥TaEXPB23的上調(diào)表達(dá)，在煙草中超表 達(dá)TaEXPB23增強(qiáng)其根系對(duì)PEG滲透脅迫的耐受性。當(dāng)植物處于逆境時(shí)，通過EXPs在細(xì)胞 壁的積累表達(dá)可能增加了細(xì)胞壁的柔韌性，在一定程度上舒緩了逆境對(duì)植物細(xì)胞的張力威 脅，增加了植物對(duì)逆境的適應(yīng)性。
[0006] 植物中關(guān)于EXPA和EXPB亞家族成員的研究較多，相對(duì)于EXP來說，EXL基因同樣 擁有EXP的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，但其氨基酸序列與EXPA和EXPB不同，它們?nèi)鄙貶FD基元，同時(shí)卻含 有更多的半胱氨酸殘基，這樣的結(jié)構(gòu)性差異又帶來什么樣的功能變化，植物中EXLA和EXLB 亞家族是否具有什么樣的功能？我們基于棉花細(xì)胞壁重建的差減文庫(kù)（Yang et al. 2008) 及 DFCI 棉花數(shù)據(jù)庫(kù)（http://compbio. dfci. harvard, edu/tgi/cgi-bin/tgi/gimain. pi ? gudb = cotton)，通過同源序列法克隆到棉花中的GhEXLB2基因。在枯草桿菌中分離到的膨 脹素類似蛋白基因EXLX1 (BsYoaJ)與植物EXP功能相似，能與多聚糖和肽聚糖結(jié)合，并增強(qiáng) 纖維素酶的活性（Kerff et al.2008;Kim et al.2009);來自普城沙雷菌的膨脹素類似蛋 白基因HcEXLX2也行使相同功能（Lee et al.2010)。植物中對(duì)EXL亞家族的成員的功能研 究較少，Lee和Kende(Lee and Kende 2002)發(fā)現(xiàn)0S-EXPL3基因與細(xì)胞的伸長(zhǎng)有關(guān)，并受 到GA的誘導(dǎo)表達(dá)。擬南芥基因組中存在三個(gè)EXLA和一個(gè)EXLB基因（http://homes, bio. 口811.6(111/61口3118；[118)，3個(gè)擬南芥4七￡乂1^基因在冷脅迫下都上調(diào)表達(dá)（1^6 6七31.2005); 最新研究發(fā)現(xiàn)AtEXLA2基因受鹽和冷誘導(dǎo)表達(dá)，AtEXLA2基因的突變體對(duì)鹽和ABA敏感 (Abuqamar et al.2013)。我們研究發(fā)現(xiàn)棉花GhEXLB2基因?qū)}、PEG和ABA均有響應(yīng)，在棉 花中超表達(dá)GhEXLBjg夠顯著增強(qiáng)植株的抗旱性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于從陸地棉中基于同源序列克隆到一個(gè)與細(xì)胞壁松弛相關(guān)的功 能基因，我們將這個(gè)基因命名為GhEXLB 2基因，通過轉(zhuǎn)化陸地棉YZ1，獲得轉(zhuǎn)基因陸地棉， 以驗(yàn)證其在棉花抗非生物逆境中的功能，為細(xì)胞壁如何參與植物抗非生物逆境提供理論依 據(jù)，并為棉花在逆境中提高產(chǎn)量提供參考。
[0008] 本發(fā)明的技術(shù)方案如下所述：
[0009] (1)本發(fā)明從陸地棉中克隆一個(gè)與棉花抗逆相關(guān)的功能基因GhEXLB 2，它的核苷酸 序列是序列表SEQ NO: 1中第1-1151位堿基所示的序列，其中在該序列表中的第150-899 位所示的序列是該基因的編碼區(qū)（即CDS，其編碼的蛋白質(zhì)序列如SEQ N0:2所示），其編碼 的蛋白與煙草!'也乂1^1編碼的蛋白同源性較高（見圖1)，序列一致性為89%，聚類分析表 明該序列編碼的蛋白屬于類膨脹素家族蛋白。根據(jù)測(cè)序驗(yàn)證后的該基因全長(zhǎng)cDNA序列信 息構(gòu)建了該基因的干涉表達(dá)載體和超表達(dá)載體，超量表達(dá)的序列是序列表SEQ N0:1中的第 150-899位所示的DNA序列。
[0010] 本發(fā)明的基因（SEQ ID NO: 1)來源于棉花，其編碼的蛋白質(zhì)由750個(gè)堿基組成，該 蛋白質(zhì)編碼249個(gè)氨基酸，是序列1自5'端第150位堿基到896位堿基組成。該基因在對(duì) 逆境脅迫，激素以及棉花生長(zhǎng)發(fā)育的影響上尚未有任何報(bào)道。通過不同的脅迫處理及激素 處理野生型棉花，檢測(cè)該基因的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)該基因受PEG模擬的干旱、鹽（NaCl)，茉莉 酸（JA)和水楊酸（SA)等處理的誘導(dǎo)表達(dá)（見圖2)。本發(fā)明分別構(gòu)建了該基因的超量表 達(dá)載體PCAMBIA2300 (超量表達(dá)的DNA序列如SEQ ID NO: 1所示的自5'端第150位堿基到 899位堿基）和干涉載體pHELLSGATE4 (干涉表達(dá)的DNA序列如SEQ ID NO: 1所示的自5' 端第847位堿基至970位堿基）（見圖3)，將這兩個(gè)載體分別轉(zhuǎn)化到豫早1號(hào)陸地棉（YZ1) 中，得到該基因的超表達(dá)和干涉轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性株系，檢測(cè)其表達(dá)量并選取具有合適表達(dá)量的2 個(gè)超表達(dá)純系和3個(gè)干涉純系進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)（見圖4)。
[0011] 當(dāng)對(duì)超表達(dá)、YZ1以及干涉轉(zhuǎn)基因萌發(fā)期進(jìn)行PEG (水勢(shì)為-o. 7MPa)模擬干旱處理 時(shí)，發(fā)現(xiàn)在正常棉花無菌苗培養(yǎng)基上，超表達(dá)系、YZ1和干涉系長(zhǎng)勢(shì)較一致，而在PEG存在的 培養(yǎng)基上，超表達(dá)系植株的主根長(zhǎng)和下胚軸長(zhǎng)顯著高于YZ1和干涉系植株（見圖5A，5B和 5C)，說明該基因的超量表達(dá)可以提高棉花對(duì)PEG的抗性。測(cè)定子葉中H 202含量發(fā)現(xiàn)處理后 H202含量呈上升趨勢(shì)，處理后超表達(dá)系H 202含量顯著低于干涉系（見圖，表明超表達(dá)系 清除干旱脅迫產(chǎn)生的活性氧能力較強(qiáng)。進(jìn)一步對(duì)超表達(dá)株系、YZ1以及干涉株系兩葉一心 期幼苗進(jìn)行PEG模擬干旱處理時(shí)，發(fā)現(xiàn)干涉系iB2-4、iB2-6、iB2-l 1和CK (YZ1)萎蔫程度較 重，而超表達(dá)系萎蔫程度較輕，轉(zhuǎn)入普通Hogland營(yíng)養(yǎng)液中，超表達(dá)系恢復(fù)較快。測(cè)定葉片 中H 202含量和MDA含量發(fā)現(xiàn)干涉系中H 202含量顯著升高，MDA含量在超表達(dá)系和干涉系之 間無顯著差異（見圖6)。
[0012] 通過干旱處理沙質(zhì)土培6周幼苗發(fā)現(xiàn)，超表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株的為萎蔫程度明顯低于 對(duì)照和干涉系植株。測(cè)定各系MDA含量發(fā)現(xiàn)，正常情況下超表達(dá)系和干涉系及對(duì)照MDA含 量較一致，但是植株受到干旱脅迫后，干涉系和對(duì)照植株MDA含量顯著高于超表達(dá)系，說明 超表達(dá)該基因能夠在一定程度上減輕植株受到干旱脅迫后的膜脂過氧化程度，從而提高植 株的耐旱性（見圖7)。
[0013] 本發(fā)明具體操作步驟如下：
[0014] 1)通過常規(guī)的 RACE (rapid-amplification of cDNA ends)方法擴(kuò)增出 GhEXLB2 的5'和3'端，將序列拼接后得到GhEXLBj^ cDNA序列全長(zhǎng)，根據(jù)測(cè)序的序列設(shè)計(jì)超表達(dá)和 干涉載體的引物，以棉花cDNA為模板，擴(kuò)增其全長(zhǎng)，獲得DNA片段，其cDNA序列全長(zhǎng)如SEQ ID N0:l(l-1151bp)所示，擴(kuò)增該基因的引物序列如下所示：
[0015] GhEXLB25r-l :5'-AGCTGCATCTTTTGTCTGAGCCATCC-3'
[0016] Gh EXLB25r-2 :5'-GAGTTTGGGTAGTAAGCTGCTCGCGA-3'
[0017] Gh EXLB23r-l :5'-GGTGCACCAACAGCCACTATTGCTCAGAC-3'
[0018] Gh EXLB23r-2 :5'-GGATGGCTCAGACAAAAGATGCAGCT-3'
[0019] GhEXLB2-F :5'-ATGGCTCTTTCTATTCAATCCCT-3'
[0020] GhEXLB2-R :5'-CTCTGGTGCAGATATCTAGATATCA-3'
[0021] 2)將步驟1)中擴(kuò)增得到的全長(zhǎng)ORF片段及表達(dá)載體酶切位點(diǎn)分布設(shè)計(jì)引物進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，回收PCR產(chǎn)物后利用利用Sac I和Pst I (購(gòu)自NEB公司，美國(guó)）對(duì)回收產(chǎn)物和 PCAMBIA2300空載體（pCAMBIA2300空載體由CAMBIA實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)，澳大利亞）分別進(jìn)行雙酶 切，酶切后進(jìn)行凝膠電泳，對(duì)目標(biāo)片段和PCAMBIA2300空載體大片段挖膠回收，利用T4DNA 連接酶對(duì)回收的目標(biāo)片段和PCAMBIA2300空載體酶切產(chǎn)物進(jìn)行連接，再通過熱激轉(zhuǎn)化大腸 桿菌感受態(tài)細(xì)胞T0P10中，獲得表達(dá)轉(zhuǎn)化載體（p35s-GhEXLB 2，由申請(qǐng)人自行制 備，武漢）。同時(shí)設(shè)計(jì)引物用于非保守區(qū)干涉，通過BP-LR反應(yīng)，將該片段先后連接到中間載 體pD0NR?221(由CSIRO Plant Industry惠贈(zèng)，澳大利亞）和干涉載體pHELLSGATE 4(由 CSIRO Plant Industry惠贈(zèng)，澳大利亞）上，再通過熱激轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞T0P10 中，獲得GhEXLB2干涉表達(dá)載體