提取新工藝的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及輔酶Q1(l的提取方法，尤其涉及一種從發(fā)酵液 中提取輔酶Q1(l的新工藝。
【背景技術(shù)】
[0002] 輔酶Q1(1是一種脂溶性天然維生素類物質(zhì)，在生物體內(nèi)起遞氫的作用，是生命體不 可缺少的重要元素之一。輔酶Q 1(l作為細(xì)胞代謝的激活劑和天然抗氧化劑在心血管疾病的 治療中起著重要作用，還可提高人體免疫力，已成為生物醫(yī)藥領(lǐng)域研宄的熱點(diǎn)。近年來也廣 泛應(yīng)用于保健品、化妝品和食品行業(yè)中。
[0003]目前輔酶Q1(l的生產(chǎn)方法主要有動(dòng)植物組織提取法、化學(xué)合成法和微生物發(fā)酵法。 動(dòng)植物組織提取法原料來源有限、目標(biāo)產(chǎn)物含量低，因此成本較高，不利于工業(yè)化生產(chǎn)；化 學(xué)合成法主要采用茄尼醇和3,4,5_三甲氧基甲苯為原料合成輔酶Q 1(l，化學(xué)合成茄尼醇得 到的是順、反異構(gòu)體的混合物，異構(gòu)體分離困難、副產(chǎn)物較多，提純成本高，因此化學(xué)合成法 生產(chǎn)輔酶Q 1(l也受到限制；微生物發(fā)酵法具有原料來源豐富、反應(yīng)條件溫和、產(chǎn)品生物活性 好、可實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，是最具發(fā)展?jié)摿Φ妮o酶Q 1(l生產(chǎn)方法。目前的微生物發(fā)酵法 仍然有需要改進(jìn)的地方。根據(jù)目前的報(bào)道，在用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)輔酶Q10時(shí)，菌體濃度和 產(chǎn)品產(chǎn)率較低，這使得生產(chǎn)成本偏高，企業(yè)利潤(rùn)率大大降低。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明需要解決的技術(shù)問題是，克服了現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足之處，提供了一種 從發(fā)酵液中提取輔酶Q 1(l的新工藝，該工藝操作簡(jiǎn)單，產(chǎn)率和純度高，能夠?qū)崿F(xiàn)廢物利用，并 且合理配伍菌株，大大提高了發(fā)酵效率，可大規(guī)模推廣使用。
[0005] 本發(fā)明的目的是通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
[0006] 一種從發(fā)酵液中提取輔酶~的新工藝，包括如下步驟：
[0007] 1)將深紅酵母（Rhodotorula rubra) ATCC 74283、球形紅細(xì)菌（Rhodobacter sphaeroides)ATCC 17025 和脫氮副球菌（Paracoccus denitrificans)ATCC 19367 分別培 養(yǎng)至成濃度為IX 108個(gè)/mL的菌液，按照1 : 1 : 2的體積比混合得到混合菌液，然后按照 5%接種量，將混合菌液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度29°C，lOOrprn搖床培養(yǎng)30小時(shí)得到發(fā) 酵液；
[0008] 2)在4000-5000rpm下離心步驟1)所得發(fā)酵液30min，分離上清液與菌體細(xì)胞，將 菌體細(xì)胞洗至中性，60°C烘干后粉碎；將粉碎的菌體細(xì)胞與正己烷按質(zhì)量比1-2 : 2-3混 合，混勻后磁力攪拌浸提，溫度55-60°C，浸提1. 5-2h，然后經(jīng)微濾膜過濾，收集提取液和截 留物；
[0009] 3)將步驟2)得到的提取液和堿醇溶液按體積比1-2 : 2-3混合，振蕩5min，靜置 分層，取有機(jī)相，在溫度55-60°C，真空度0. 04-0. 06Mpa旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，所得濃縮液用正己 烷重溶；
[0010] 4)對(duì)步驟3)所得液體進(jìn)行硅膠柱層析，然后在溫度55-60°C，真空度 0. 04-0. 06Mpa條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮；將所得濃縮液溶解于無水乙醇中，0-4°C下冷藏過夜， 抽真空過濾得輔酶Q1(l膠體；最后在溫度2-KTC條件下真空干燥，即得；
[0011] 5)將步驟2)所得上清液和截留物合并得到復(fù)合物A，然后往復(fù)合物A中添加豆 柏、酒糟、水稻秸桿粉以及麥麩，2000rpm攪拌lOmin，通入蒸汽升溫至10(TC，蒸餾30分鐘； 然后將蒸餾物烘干，粉碎機(jī)粉碎制得飼料；其中，復(fù)合物A、豆柏、酒糟、水稻秸桿粉以及麥 麩的質(zhì)量比為100 : 3 : 2 : 1 : 1。
[0012] 優(yōu)選地，
[0013] 所述堿醇溶液為：氯化鈉80g、氫氧化鈉20g、甲醇80mL，余量為水，定容至1L。
[0014]所述發(fā)酵培養(yǎng)基為：葡萄糖 10g，蛋白胨 5g，（NH4)2S04 5g，KH2P04 1. Og，Na2HP04 0? 5g，MgS04 0? 5g，水 1000mL，pH 7. 0。
[0015] 所述微濾膜為無機(jī)陶瓷膜，截留分子量為2000Da，微濾溫度為40°C。
[0016] 本發(fā)明所述菌種均可以從美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫（ATCC)等商業(yè)渠道購買得到； 其培養(yǎng)方式可按照現(xiàn)有技術(shù)來完成，其并未本發(fā)明的創(chuàng)新點(diǎn)，此處并不一一贅述。
[0017] 本發(fā)明的技術(shù)方案具有以下突出優(yōu)點(diǎn)及獨(dú)特性：
[0018] 本發(fā)明在現(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)上，通過大量試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，采用三種菌液按照一定比例混 合，各菌株之間具備一定的協(xié)同作用，比常規(guī)的單一菌株發(fā)酵方法，能夠大大提高輔酶Q10 的產(chǎn)量，其他條件不變的前提下，較產(chǎn)量較酵母單一菌株發(fā)酵可提高20%以上。
[0019] 本發(fā)明采用有機(jī)溶劑-堿醇皂化萃取相結(jié)合的方法，有機(jī)溶劑萃取成本低、對(duì)輔 酶Q 1(l破壞性較?。粔A醇皂化能去除脂肪酸甘油酯和及各種游離脂肪酸，是適用于大規(guī)模生 產(chǎn)的提取方法。
[0020] 本發(fā)明選用特殊皂化液，避免采用單一堿溶液（如氫氧化鈉溶液）皂化產(chǎn)生乳化 現(xiàn)象；又避免堿性-乙醇溶液皂化使輔酶9 1(|的甲氧基和乙醇的乙氧基換位，從而導(dǎo)致新雜 質(zhì)的廣生；廣率和純度均可提尚10%以上。
[0021] 本發(fā)明在提取輔酶Q1(1過程中，對(duì)菌體蛋白、大分子多糖等進(jìn)行回收利用，幾乎無 廢水外排，避免此類物質(zhì)的廢液對(duì)環(huán)境造成的污染，綠色環(huán)保；而且獲得了營(yíng)養(yǎng)豐富的菌體 蛋白飼料，變廢為寶，增加經(jīng)濟(jì)效益。
【具體實(shí)施方式】
[0022] 為了使本技術(shù)領(lǐng)域的人員更好地理解本申請(qǐng)中的技術(shù)方案，下面將結(jié)合本申請(qǐng)具 體實(shí)施例，對(duì)本申請(qǐng)的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本申 請(qǐng)一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒旧暾?qǐng)中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒 有作出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都應(yīng)當(dāng)屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0023] 實(shí)施例1
[0024] 一種從發(fā)酵液中提取輔酶Q1(l的新工藝，其包括如下步驟：
[0025]1)將深紅酵母（Rhodotorula rubra)ATCC74283(可參見 US5474919A)、球 形紅細(xì)菌（Rhodobacter sphaeroides)ATCC17025(可參見 Journal of Biological Chemistry2001，V276，No44，P41161-41164)和脫氮副球菌（Paracoccus denitrificans) ATCC 19367 (可參見 J.Bacteriol. April 1996V178, No7, pl866-1871)分別培養(yǎng)至成濃度 為IX 108個(gè)/mL的菌液，按照1 : 1 : 2的體積比混合得到混合菌液，然后按照5% (v/v) 接種量，接種于發(fā)酵培養(yǎng)基（葡萄糖l〇g，蛋白胨5g，（NH4)2S04 5g，KH2P04l. 0g，Na2HP040. 5g， MgS040. 5g，水1000mL，pH 7. 0)，培養(yǎng)溫度29°C，lOOrpm搖床培養(yǎng)30小時(shí)得到發(fā)酵液，測(cè)得 細(xì)胞干重為120g/L ;
[0026] 2)在4000rpm下離心發(fā)酵液30min，分離上清液與菌體細(xì)胞，將菌體細(xì)胞洗至中 性，60°C烘干后粉碎；將粉碎的菌體細(xì)胞與正己烷按質(zhì)量比1 : 2混合，混勻后磁力攪拌浸 提，溫度55°C，浸提1. 5h，經(jīng)微濾膜過濾，收集提取液和截留物；所述微濾膜為無機(jī)陶瓷膜， 截留分子量為2000Da，過濾溫