用于多重連接擴(kuò)增技術(shù)的探針制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及寡核苷酸探針制備，具體地為可用于多重連 接擴(kuò)增技術(shù)（MLPA)的長(zhǎng)探針的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)（multiplex ligation-dependent probe amplification, MLPA)于2002年由Schouten等首先報(bào)道，是近幾年發(fā)展起來(lái)的一種針對(duì)待 檢DNA序列進(jìn)行定性和半定量分析的新技術(shù)。該技術(shù)高效、特異，在一次反應(yīng)中可以檢測(cè)45 個(gè)核苷酸序列拷貝數(shù)的改變。目前MLPA技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于多個(gè)領(lǐng)域、多種疾病的研究及基因 診斷，并且不斷的有新的技術(shù)改進(jìn)。
[0003] 中國(guó)專利申請(qǐng)200910108977. 4公開(kāi)了一種采用PCR方法結(jié)合親和素磁殊法制備 可用于多重連接擴(kuò)增技術(shù)的長(zhǎng)探針，該公開(kāi)的技術(shù)方法主要包括：針對(duì)目標(biāo)核苷酸序列和 用于制備長(zhǎng)探針的與待檢測(cè)靶片段無(wú)關(guān)的模板核苷酸序列設(shè)計(jì)一對(duì)PCR擴(kuò)增引物，分別為 通用引物和檢測(cè)引物；通用引物的5'端標(biāo)記生物素；以所述與待檢測(cè)靶片段無(wú)關(guān)的模板核 苷酸序列為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得生物素標(biāo)記的雙鏈核苷酸序列；將生物素標(biāo)記的雙鏈 核苷酸序列與鏈霉素素標(biāo)記的親和素磁珠混合，使生物素標(biāo)記的雙鏈核苷酸序列與鏈霉親 和素磁珠特異性結(jié)合；使生物素標(biāo)記的的雙鏈核苷酸序列變性，解鏈形成單鏈；離心取上 清，獲得非生物素標(biāo)記的單鏈核苷酸序列。該方法雖然操作簡(jiǎn)單，但是在磁珠分離過(guò)程中不 可避免地會(huì)因磁珠結(jié)合不完全造成上清中的雙鏈核苷酸殘留，影響探針得率。
[0004] 在中國(guó)專利申請(qǐng)201210008247. 9中公開(kāi)了一種采用PCR方法結(jié)合入外切酶酶切 制備可用于多重連接擴(kuò)增技術(shù)的長(zhǎng)探針，該公開(kāi)的技術(shù)方法主要包括：設(shè)計(jì)一對(duì)與待測(cè)靶 片段及長(zhǎng)探針核苷酸序列無(wú)關(guān)的檢測(cè)引物，分別為GP1 (5'端帶熒光基團(tuán)修飾）和GP2,用 于最后的PCR擴(kuò)增檢測(cè)，同時(shí)合成5'端帶磷酸化修飾的右探針RP0-N，由目的右探針序列 與GP2的反向互補(bǔ)序列組成；確定一段與探針及通用引物無(wú)關(guān)的核苷酸序列S，并用于設(shè)計(jì) 一對(duì)擴(kuò)增左端長(zhǎng)探針的引物，分別為GPL和LP0-N'，其中GPL是由GP1的序列與S序列的前 18bp左右的序列組成，LP0-N'由目的左探針序列的反向互補(bǔ)序列與S序列中的18bp左右 反向互補(bǔ)的序列組成，并且其5'端要帶上磷酸化修飾；用GPL和LPN以所述的一段與探針 及通用引物無(wú)關(guān)的核酸序列為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得互補(bǔ)鏈5'端磷酸化修飾的雙鏈核苷 酸序列；純化回收PCR產(chǎn)物；采用核酸Lamda外切酶對(duì)以上雙鏈核苷酸序列進(jìn)行消化，去除 5'磷酸化標(biāo)記的那條單鏈DNA ;采用ssDNA純化回收試劑盒對(duì)消化產(chǎn)物進(jìn)行回收，便得到左 端長(zhǎng)探針。該方法雖然成本低廉，但是混合酶切，容易造成雙鏈核苷酸殘留，導(dǎo)致探針得率 不商。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 所要解決的技術(shù)問(wèn)題
[0006] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種低成本、高得率的可用于多重連接擴(kuò)增技 術(shù)的長(zhǎng)探針制備方法，以克服現(xiàn)有技術(shù)在磁珠分離過(guò)程中由磁珠結(jié)合不完全造成雙鏈核苷 酸殘留，探針得率不高的缺陷。
[0007] 技術(shù)方案
[0008] 本發(fā)明的技術(shù)方案之一是提供用于多重連接擴(kuò)增技術(shù)的探針制備方法，包括以下 步驟：
[0009] 1)設(shè)計(jì)一對(duì)與待測(cè)目的基因及長(zhǎng)探針核苷酸序列無(wú)關(guān)的通用檢測(cè)引物，分別為上 游引物CF和下游引物CR;
[0010] 2)合成左側(cè)短探針S，5'到3'序列分別由所述上游引物CF序列與目的片段左側(cè) 序列TF組成；
[0011] 3)確定一段與目的基因及通用引物無(wú)關(guān)的核苷酸序列T，設(shè)計(jì)一對(duì)擴(kuò)增右側(cè)長(zhǎng)探 針的引物，分別為L(zhǎng)F和LR，其中LF的5'到3'序列分別是由目的片段右側(cè)序列TR與所述 T序列5'端的10-25bp堿基組成，LR的5'到3'序列分別由下游引物CR序列與所述T序 列3'端的10-25bp堿基的反向互補(bǔ)序列組成，并且LF引物的5'端用生物素標(biāo)記，LR引物 的5'端憐酸化；
[0012] 4)利用上述引物L(fēng)F和LR，以所述的核苷酸序列T為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得5' 端生物素標(biāo)記的正義鏈以及5'端磷酸化標(biāo)記的互補(bǔ)鏈形成的雙鏈核苷酸序列；
[0013] 5)將純化后的上述雙鏈核苷酸序列與鏈霉親和素磁珠混合孵育，使5'端標(biāo)記生 物素的雙鏈核苷酸與磁珠特異性結(jié)合；
[0014] 6)利用外切酶對(duì)5'端標(biāo)記磷酸化的互補(bǔ)鏈DNA進(jìn)行酶切；純化回收5'端標(biāo)記生 物素的正義鏈DNA，即目的片段的右側(cè)長(zhǎng)探針；
[0015] 或者，上述的步驟2)~4)由下列步驟2'）~4'）替代，以獲得目的片段的左側(cè) 長(zhǎng)探針：
[0016] 2'）合成右側(cè)短探針Z，5'到3'序列分別由所述目的片段右側(cè)序列TR與下游引 物CR的反向互補(bǔ)序列組成；
[0017] 3'）確定一段與目的基因及通用引物無(wú)關(guān)的核苷酸序列T，用于設(shè)計(jì)一對(duì)擴(kuò)增左 側(cè)長(zhǎng)探針的引物，分別為L(zhǎng)F'和LR'，其中LF'的5'到3'序列分別是由上游引物CF序列與 所述T序列5'端10-25bp堿基組成，LR'的5'到3'序列分別由目的片段左側(cè)序列TF的 反向互補(bǔ)序列與所述T序列3'端10-25bp的反向互補(bǔ)序列組成，并且LF'引物的5'端標(biāo) 記生物素，LR'引物的5'端標(biāo)記磷酸化；
[0018] 4'）利用上述引物L(fēng)F'和LR'，以所述的核苷酸序列T為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得 5'端生物素標(biāo)記的正義鏈以及5'端磷酸化標(biāo)記的互補(bǔ)鏈形成的雙鏈核苷酸序列。
[0019] 上述的探針制備方法的優(yōu)選方案之一為，使用獲得的右側(cè)長(zhǎng)探針與人工合成的左 側(cè)短探針進(jìn)行MLPA驗(yàn)證；或者，使用獲得的左側(cè)長(zhǎng)探針與人工合成的右側(cè)短探針進(jìn)行MLPA 驗(yàn)證。
[0020] 上述的探針制備方法的優(yōu)選方案之二為，所述的右側(cè)長(zhǎng)探針的5'到3'序列依此 包含TR、T和CR反向互補(bǔ)序列；所述的左側(cè)長(zhǎng)探針的5'到3'序列依此包含CF正向序列、 T和TF;右側(cè)長(zhǎng)探針的TR序列、或者左側(cè)長(zhǎng)探針的TF序列的設(shè)計(jì)中引入了目的片段的中存 在的核苷酸突變、缺失或者重復(fù)位點(diǎn)。
[0021] 上述的探針制備方法的優(yōu)選方案之三為，步驟1)所述通用檢測(cè)引物是一對(duì)與人 類基因組、長(zhǎng)探針核苷酸序列及待測(cè)目的基因無(wú)關(guān)的序列。
[0022] 上述的探針制備方法的優(yōu)選方案之四為，步驟2)所述短探針為人工合成。
[0023] 上述的探針制備方法的優(yōu)選方案之五為，步驟3)或步驟3'）所述的一段與目的基 因及通用引物無(wú)關(guān)的核苷酸序列T為長(zhǎng)探針的可變序列，位于目的片段與通用引物之間， 可獲得不同長(zhǎng)度的探針鏈；步驟3)所述的引物L(fēng)F和LR、以及步驟3'）所述的引物L(fēng)F'和 LR'均由根據(jù)目的片段序列設(shè)計(jì)的5'端或3'端和根據(jù)所述序列T設(shè)計(jì)的5'端或3'端組 成。
[0024] 上述的探針制備方法的優(yōu)選方案之六為，步驟4)或者4'）獲得的雙鏈核苷酸序列 經(jīng)過(guò)純化后再與鏈霉親和素磁珠進(jìn)行混合孵育。
[0025] 上述的探針制備方法的優(yōu)選方案之七為，步驟5)所述每1份重量份生物素標(biāo)記的 雙鏈核苷酸與1-30份重量份的鏈霉親和素磁珠混合，混合后需要回收孵育液進(jìn)行電泳檢 測(cè)以確認(rèn)孵育完全并且無(wú)雙鏈核苷酸序列殘留。
[0026] 上述的探針制備方法的優(yōu)選方案之八為，步驟6)所述的外切酶為A噬菌體核酸 外切酶，酶切反應(yīng)中需要回收酶切液進(jìn)行電泳檢測(cè)以確認(rèn)酶切完全并且無(wú)雙鏈核苷酸序列 殘留；步驟5)及步驟6)回收純化磁珠后需進(jìn)行PCR驗(yàn)證以確認(rèn)完全結(jié)合。
[0027] 本發(fā)明的技術(shù)方案之二是提供一種用于上述技術(shù)方案之一制備方法的試劑盒。
[0028] 有益效果
[0029] 本發(fā)明所的探針制備方法與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)：
[0030] 1)PCR擴(kuò)增引物簡(jiǎn)單，通過(guò)結(jié)合目標(biāo)序列，針對(duì)模版T設(shè)計(jì)一對(duì)引物即可。
[0031] 2)利用簡(jiǎn)單的PCR和鏈霉親和素磁珠親和純化以及A噬菌體核酸外切酶消化酶 切即可獲得長(zhǎng)探針，可4小時(shí)內(nèi)快速制備大量長(zhǎng)探針，大大降低了 MLPA技術(shù)門檻。
[0032] 3)無(wú)需進(jìn)行克隆制備，無(wú)需序列特異性酶切，操作簡(jiǎn)單。
[0033] 4)探針制備靈活性更強(qiáng)，可針對(duì)基因組DNA、質(zhì)粒、人工基因序列等制備所需探 針。
[0034] 5)探針?biāo)璧男蛄衼?lái)源方便，可使不同探針的填充T序列保持一致，也可根據(jù)需 要選擇不同模版擴(kuò)增所需序列，降低雜交時(shí)的非特異性雜交，提高檢測(cè)成功率。
【附圖說(shuō)明】
[0035] 圖1本發(fā)明的方法流程圖。
[0036] 圖2瓊脂糖電泳圖。
[0037] 圖3A本發(fā)明實(shí)施例中的鏈霉親和素磁珠孵育后回收孵育液的瓊脂糖電泳圖；
[0038] 圖3B本發(fā)明實(shí)施例中的A噬菌體核酸外切酶酶切反應(yīng)后回收酶切液的瓊脂糖電 泳圖；
[0039] 圖4本發(fā)明實(shí)施例中的MLPA瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果圖。
[0040] 圖5-圖9本發(fā)明實(shí)施例中的瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0041] 下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人 員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定 的范圍。
[0042] 下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，如：分子克隆操作 手冊(cè)，或按照制造廠商所建議的條件。所有無(wú)機(jī)化學(xué)試劑和有機(jī)溶劑購(gòu)自國(guó)藥試劑有限公 司，細(xì)菌DNA提取試劑盒購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司，A噬菌體核酸外切酶購(gòu)自紐 英倫生物技術(shù)有限公司、高保真酶套裝購(gòu)自紐英倫生物技術(shù)有限公司，鏈霉親和素磁珠購(gòu) 自英俊生物技術(shù)有限公司，引物和