雜交瘤細(xì)胞dbp-4e10及其產(chǎn)生的鄰苯二甲酸二丁酯單克隆抗體的制作方法
【專利說(shuō)明】雜交瘤細(xì)胞DBP-4E10及其產(chǎn)生的鄰苯二甲酸二丁酯單克隆抗體
[0001]
技術(shù)領(lǐng)域
[0002]本發(fā)明涉及雜交瘤細(xì)胞株DBP-4E10及其產(chǎn)生的鄰苯二甲酸二丁酯單克隆抗體。
【背景技術(shù)】
[0003]鄰苯二甲酸酯類化合物(PAEs)是一類環(huán)境激素類物質(zhì)，具有雌激素活性，干擾生物體內(nèi)分泌系統(tǒng)正常功能、導(dǎo)致突變、畸變和癌細(xì)胞增殖。2005年，歐盟將鄰苯二甲酸二辛酯(DEHP)，鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)及鄰苯二甲酸丁芐酯(BBP)評(píng)定為“第二類生殖毒性”。其中，DBP被認(rèn)為是毒性最高的酞酸酯類化合物。
[0004]PAEs化合物是塑料工業(yè)的主要增塑劑和軟化劑，廣泛應(yīng)用于食品包裝材料、容器、醫(yī)療用品及塑料等的制造。由于其廣泛應(yīng)用以及從各種制品中的釋放，酞酸酯類化合物已經(jīng)幾乎滲透到我們生活的每一個(gè)角落。研宄表明，我國(guó)居民DBP每日攝入量為12.2mg/kg，超過(guò)世界衛(wèi)生組織建議的10mg/kg.d的每日最大容許攝入量標(biāo)準(zhǔn)。食品被認(rèn)為是人類暴露于酞酸酯類化合物的主要途徑。食品中酞酸酯類化合物的污染主要來(lái)自于食品的塑料包裝以及生產(chǎn)過(guò)程。這是因?yàn)樘狨ナ且环N脂溶性化合物，它很容易進(jìn)入食品的脂肪、油脂中，并在其中富集。
[0005]DBP現(xiàn)有的檢測(cè)方法GC、MS、HPLC測(cè)定DBP靈敏度高、精確度好，而且能分別測(cè)定結(jié)構(gòu)相似的多種化合物及其異構(gòu)體，是目前最理想的檢測(cè)方法。但是這類分析方法體系將待測(cè)污染物從樣品中分離提取并去除雜質(zhì)干擾的前處理過(guò)程十分復(fù)雜，操作費(fèi)時(shí)，分析成本昂貴。所以開(kāi)發(fā)操作簡(jiǎn)單、快速、經(jīng)濟(jì)且靈敏度高的檢測(cè)方法具有重要的實(shí)際意義。
[0006]免疫分析方法將免疫反應(yīng)的高特異性和現(xiàn)代測(cè)試手段高靈敏性相結(jié)合，具有快速、經(jīng)濟(jì)、樣品所需量少、前處理簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，成為現(xiàn)代生物化學(xué)、醫(yī)學(xué)、化學(xué)分析和環(huán)境監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域的研宄熱點(diǎn)。免疫分析是利用抗原抗體的特異性的結(jié)合反應(yīng)和抗原、抗體上的標(biāo)記物的放大作用來(lái)對(duì)超微量待測(cè)物進(jìn)行定性、定量檢測(cè)，所以要研宄建立針對(duì)鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)的任何一種免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)，都必須先獲得抗鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)的抗體。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明所要解決的問(wèn)題是提供雜交瘤細(xì)胞株DBP-4E10及其產(chǎn)生的鄰苯二甲酸二丁酯DBP的單克隆抗體
本發(fā)明提供了雜交瘤細(xì)株DBP-4E10，該細(xì)胞株已于2014年12月12日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是，中國(guó)，北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研宄所，保藏編號(hào)為CGMCC N0.10202。分類命名為S/P20雜交瘤細(xì)胞。
[0008]抗鄰苯二甲酸二丁酯單克隆抗體由保藏編號(hào)為CGMCC N0.10202的雜交瘤細(xì)胞株DBP-4E10分泌產(chǎn)生。該DBP單克隆抗體可以識(shí)別鄰苯二甲酸二丁酯，對(duì)鄰苯二甲酸二丁酯的50%抑制濃度IC50為0.22 mg/Lo
[0009]抗鄰苯二甲酸二丁酯單克隆抗體在鄰苯二甲酸二丁酯測(cè)定中的應(yīng)用。
[0010]本發(fā)明提供的雜交瘤細(xì)胞株DBP-4E10單克隆抗體是采用三步法篩選獲得的，其具體步驟是:以4-硝基鄰苯二甲酸酐在H2SO4作用下和正丁醇反應(yīng)生成4-硝基鄰苯二甲酸二丁酯，然后將硝基還原成氨基，在最后在鹽酸和亞硝酸鈉的存在下發(fā)生重氮化作用然后和BSA偶聯(lián)生成DBP-BSA。用其免疫BLAB/c小鼠4次，最后一次加強(qiáng)免疫用2倍與前一次免疫劑量的DBP-BSA，免疫3天后進(jìn)行細(xì)胞融合。采用ELISA分兩步法進(jìn)行篩選融合細(xì)胞:第一步采用間接ELISA法篩選出僅能抗鄰苯二甲酸二丁酯而不抗載體蛋白BSA的陽(yáng)性克?。坏诙讲捎瞄g接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法對(duì)第一步篩選出的陽(yáng)性克隆培養(yǎng)液進(jìn)行檢測(cè)，采用DBP作為競(jìng)爭(zhēng)源，選擇吸光度值低、靈敏度較高的陽(yáng)性克隆進(jìn)行有限稀釋法繼續(xù)克隆，克隆10天后采用同樣的兩步篩選法進(jìn)行抗體檢測(cè)，如此重復(fù)2次，最終篩選獲得的雜交瘤細(xì)胞DBP-4E10。
[0011]本發(fā)明提供的鄰苯二甲酸二丁酯單克隆抗體的制備方法，步驟如下:將獲得的雜交瘤細(xì)胞株DBP-4E10注射預(yù)先用弗氏不完全佐劑處理過(guò)的BALB/c小鼠，收集該小鼠的腹水，純化處理后獲得抗鄰苯二甲酸二丁酯的單克隆抗體。
[0012]上述純化方法的具體操作為:腹水于4°C，3000r/min離心5min以上，吸取上清，將上清與2倍體積的醋酸鹽緩沖液混合，邊攪拌邊緩慢加入正辛酸，每毫升腹水所需的正辛酸體積為33yL，室溫混合30min，4°C靜置2h以上，使其充分沉淀。然后4°C，12000r/min離心30min以上，棄沉淀，將得到的上清液用砂芯漏斗過(guò)濾后，加入1/10濾液體積的0.1mol/L ρΗ7.4的磷酸鹽緩沖液，用2 mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至7.4，4°C預(yù)冷I小時(shí)，緩慢加入0.277g/mL硫酸銨至硫酸銨終濃度為45%，4°C靜置2h以上，然后40C 12000r/min離心30min，棄上清，將所得沉淀用原腹水體積1/10的0.01mol/L磷酸鹽緩沖液重懸，裝入透析袋，用0.01mol/L磷酸鹽緩沖液透析，將充分透析好的蛋白溶液加入等體積甘油，置-20°C冰箱中備用；
醋酸鹽緩沖液:0.29g醋酸鈉加入0.141mL醋酸，純水定容至10mL ；
0.1mol/L磷酸鹽緩沖液:0.8g氯化鈉，0.29g十二水磷酸氫二鈉，0.02g氯化鉀，
0.02g磷酸二氫鉀，加水定容至100mL。
[0013]0.01mol/L磷酸鹽緩沖液:用純水將0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液稀釋10倍。
[0014]本發(fā)明的有益效果在于:
I本發(fā)明提供的雜交瘤細(xì)胞DBP-4E10可以用于制備高效價(jià)的抗鄰苯二甲酸二丁酯單克隆抗體，將鄰苯二甲酸二丁酯小鼠腹水抗體酶聯(lián)免疫吸附方法測(cè)定的效價(jià)達(dá)到3.12X 106，即腹水稀釋至3.12 X 16時(shí)溶液測(cè)定結(jié)果仍為陽(yáng)性。
[0015]2本發(fā)明提供的鄰苯二甲酸二丁酯單克隆抗體靈敏度高、特異性好，對(duì)鄰苯二甲酸二丁酯的半抑制濃度IC50為0.22 mg/L，與鄰苯二甲酸二乙丁酯的交叉反應(yīng)率36.9%，與鄰苯二甲酸丁芐酯的交叉反應(yīng)率10.7%，與其他結(jié)構(gòu)類似物的交叉反應(yīng)率均小于1%。
[0016]3本發(fā)明提供的抗鄰苯二甲酸二丁酯的單克隆抗體可用于測(cè)定鄰苯二甲酸二丁酯的含量。
【附圖說(shuō)明】
[0017]圖1 DBP-4E10單克隆抗體對(duì)DBP的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0018]實(shí)施例1:雜交瘤細(xì)胞株DBP-4E10的篩選
1.抗原的合成及動(dòng)物的免疫
4-硝基鄰苯二甲酸酐與正丁醇生條件下發(fā)生酯化反應(yīng)，得到4-硝基鄰苯二甲酸二丁酯，再在酸性條件下與鋅粉發(fā)生還原反應(yīng)，得到半抗原衍生物4-氨基鄰苯二甲酸二丁酯酯，有苯氨基的鄰苯二甲酸酯半抗原衍生物在低溫下與NaN02和濃HCl發(fā)生重氮化反應(yīng)，生成相應(yīng)的重氮鹽；重氮鹽與載體蛋白發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)，得到相應(yīng)的人工抗原。
[0019]4-硝基鄰苯二甲酸二丁酯的合成
將2.5克4-硝基鄰苯二甲酸溶于50mL正丁醇中，向其中緩慢滴入ImL濃H2S04作催化劑，在120°C下反應(yīng)并不斷攪拌。反應(yīng)結(jié)束后，用10%NaC03洗滌三次，每次10mL。80°C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去正丁醇和水。得油狀物質(zhì)4-硝基鄰苯二甲酸二丁酯，稱重。
[0020]4-氨基鄰苯二甲酸二丁酯酯的合成
稱取0.1523克4-硝基鄰苯二甲酸二丁酯；加入28mL苯和0.28g鋅粉，然后分三次加入8.2mL濃HC1，攪拌反應(yīng)18min后再加入0.28克鋅粉，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)12h。反應(yīng)結(jié)束后，分液；然后用34mLH20清洗苯層，分別用5g無(wú)水Na2S04干燥苯層三次，50°C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去苯。得黃色4-氨基鄰苯二甲酸二丁酯固體，稱重。
[0021]人工抗原的合成
配置A液:稱取0.0466克4-氨基鄰苯二甲酸二丁酯于50mL三角瓶中，依次加入0.1mL濃HCl、3mLH20和2mL 二甲基甲酰胺。置冰浴5度下，攪拌。逐滴加入0.2mol/L亞硝酸鈉，至淀粉KI試紙變藍(lán)，反應(yīng)30分鐘。
[0022]配置B液:4mg/mLBSA的硼酸鈉緩沖溶液(ρΗ9.0) 40mL。
[0023]將B液逐滴加入A液中，逐漸有橙紅色溶液出現(xiàn)，繼續(xù)反應(yīng)2h，得粗產(chǎn)品。反應(yīng)液裝入透析袋中，磷酸鹽緩沖液(PH7.4 0.0lmol/L)透析3天，每天換兩次透析液。收集透析袋內(nèi)的液體，即為制得的DBP-BSA人工抗原。
[0024]人工抗原的鑒定
通過(guò)紫外光譜掃描法鑒定表明制備得到了鄰苯二甲酸二丁酯的完全抗原DBP-BSA。
[0025]購(gòu)買(mǎi)6周齡雌性BALB/c小鼠6只，免疫自行合成的鄰苯二甲酸二丁酯的完全抗原DBP-BSA。第一次免疫將完全抗原DBP-BSA與等量弗氏完全佐劑混合乳化，然后小鼠頸背部皮下多點(diǎn)注射。第二次免疫于首免3周后進(jìn)行，采用弗氏不完全佐劑與等體積完全抗原DBP-BSA乳化，免疫劑量與方法與首免相同。第三次免疫與第二次免疫間隔時(shí)間3周，免疫劑量和方法與第二次相同。第四次免疫于第三次免疫3周后進(jìn)行，免疫方式及免疫劑量與第三次免疫相同，每次免疫劑量為每鼠50yg。前3次每次免疫后一周，眼周采血，分離血清，采用間接ELISA法監(jiān)測(cè)小鼠血清抗體效價(jià)。第4次免