一種適用于淡水紅藻dna的提取方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于藻類DNA的提取方法技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種適用于淡水紅藻DNA的提取方法。
【背景技術(shù)】
[0002]現(xiàn)代的紅藻大多數(shù)為海洋紅藻，淡水紅藻的種類較少。有的學(xué)者認為淡水紅藻可能是在地質(zhì)變迀過程中，海洋紅藻在海陸交替時殘留在淡水中的孑遺生物。因此，淡水紅藻是藻類進化中的重要類群，研宄淡水紅藻的起源、系統(tǒng)發(fā)育、生理生態(tài)具有重要的學(xué)術(shù)價值。然而，提取高質(zhì)量的DNA樣品，是進行這些研宄的基礎(chǔ)。
[0003]目前常用的藻類植物DNA的提取方法主要是CTAB法等常規(guī)的植物組織DNA的提取方法，市面上也沒有專門針對藻類植物DNA提取的試劑盒，主要是一些植物總DNA提取試劑盒，而這些試劑盒對于淡水紅藻特別是串珠藻屬和熊野屬的藻類來說通常是不適用的，很難提取到高質(zhì)量的DNA。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是解決現(xiàn)有用于提取淡水紅藻DNA的提取試劑盒存在無法提取高質(zhì)量DNA的技術(shù)問題，提供一種適用于淡水紅藻DNA的提取方法。
[0005]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為:
[0006]一種適用于淡水紅藻DNA的提取方法，包括以下步驟:
[0007]I)取淡水紅藻藻體100_150mg置于研缽中，向研缽中加入適量液氮，將淡水紅藻藻體研磨成粉末；
[0008]2)將研磨好的淡水紅藻藻體粉末置于第一個2.0ml的離心管中，并向離心管中加入Iml的多糖溶解緩沖液，充分混勻后將離心管置于55°C的水浴或金屬浴中加熱lh，在浴熱過程中間隔顛倒混勻；
[0009]3)將浴熱混勻后的淡水紅藻藻體冷卻至常溫，在5000rpm的轉(zhuǎn)速下離心處理3min，棄上清，收集沉淀物；
[0010]4)向步驟3)收集的沉淀物中依次加入800 μ1 55°C預(yù)熱的DNA提取緩沖液、2 μ I β -巰基乙醇和6-8 μ I濃度為20mg/L的蛋白酶K，充分混勻后置于55°C的水浴或金屬浴中加熱lh，浴熱過程中每1min顛倒混勻一次；
[0011 ] 5)向步驟4)制備的混合液中加入800 μ I的水飽和酚，溫和混勻5min，在13000rpm的轉(zhuǎn)速下離心處理3min，取上清液置于第二個2.0ml的離心管中；
[0012]6)向步驟5)制備的上清液中加入與上清液相同體積的酚、氯仿和異戊醇的混合物，其中酚、氯仿與異戊醇的體積比為25:24:1，輕搖萃取5min，室溫下在13000rpm的轉(zhuǎn)速下離心處理3min，取上清液置于第三個2.0ml的離心管中；
[0013]7)向步驟6)制備的上清液中加入與上清液相同體積的酚、氯仿和異戊醇的混合物，其中酚、氯仿與異戊醇的體積比為25:24:1，輕搖萃取5min，室溫下在13000rpm的轉(zhuǎn)速下離心處理3min，取上清液置于第四個2.0ml的離心管中；
[0014]8)向步驟7)制備的上清液中加入與上清液相同體積的氯仿和異戊醇的混合物，其中氯仿與異戊醇的體積比為24:1，輕搖萃取5min，室溫下在13000rpm的轉(zhuǎn)速下離心處理3min，取上清液置于第五個2.0ml的離心管中；
[0015]9)向步驟8)制備的上清液中加入_20°C預(yù)冷的無水乙醇和pH為5.2濃度為3mol/L的醋酸鈉，其中無水乙醇與上清液的體積比為2:1，醋酸鈉與上清液的體積比為1:10，輕搖混勻并在-20°C的溫度下冷凍30min或在常溫下靜置直至絮狀物出現(xiàn)，并于室溫下在1000rpm的轉(zhuǎn)速下離心處理20min，棄上清，收集沉淀物；
[0016]10)向步驟9)收集的沉淀物中加入Iml濃度為75%溫度為40°C預(yù)熱的乙醇，輕搖洗滌沉淀，并于室溫下在1000rpm的轉(zhuǎn)速下離心處理5min，棄上清，收集沉淀物；
[0017]11)在室溫下將步驟10)收集的沉淀物置于通風(fēng)處揮發(fā)乙醇，待沉淀物透明后，向透明溶液中加入50 μ I的超純水或TE溶液，并在4°C的溫度下靜置Ih后即得淡水紅藻DNA。
[0018]所述步驟2)中使用的多糖溶解緩沖液為濃度為0.5-lmol/L的葡萄糖溶液。
[0019]所述步驟4)中使用的DNA提取緩沖液為濃度為0.lmol/L的三羥甲基氨基甲烷堿、pH為8.0濃度為0.05mol/L的乙二胺四乙酸二鈉水溶液、濃度為0.5mol/L的氯化鈉水溶液或質(zhì)量分數(shù)為I %的十二烷基硫酸鈉水溶液中的任意一種。
[0020]所述淡水紅藻藻體為用硅膠干燥后的冷凍淡水紅藻藻體。
[0021]所述的淡水紅藻為串珠藻屬或熊野屬。
[0022]本發(fā)明采用以上技術(shù)方案，有效解決了傳統(tǒng)或改良的CTAB法在提取的總DNA時純度不高的問題，并能消除淡水紅藻藻體由于多糖類物質(zhì)含量較高而造成的DNA提取失敗或雜質(zhì)較多等影響，提供了一種能夠獲得完整的、高質(zhì)量的淡水紅藻的總DNA的方法，能夠滿足后續(xù)PCR擴增等常規(guī)分子生物學(xué)研宄需要。
【附圖說明】
[0023]圖1是本發(fā)明第一種實施方式提取的DNA的電泳圖；
[0024]圖2是本發(fā)明第二種實施方式提取的DNA的電泳圖；
[0025]圖3是本發(fā)明第三種實施方式提取的DNA的電泳圖；
【具體實施方式】
[0026]實施例1
[0027]本實施例中所述的一種適用于淡水紅藻DNA的提取方法，包括以下步驟:
[0028]I)取用硅膠干燥后的串珠藻屬淡水紅藻藻體10mg置于研缽中，向研缽中加入適量液氮，將串珠藻屬淡水紅藻藻體研磨成粉末；
[0029]2)將研磨好的串珠藻屬淡水紅藻藻體粉末置于第一個2.0ml的離心管中，并向離心管中加入Iml濃度為0.5mol/L的葡萄糖溶液，充分混勻后將離心管置于55°C的水浴中加熱lh，在浴熱過程中間隔顛倒混勻；
[0030]3)將浴熱混勻后的串珠藻屬淡水紅藻藻體冷卻至常溫，在5000rpm的轉(zhuǎn)速下離心處理3min，棄上清，收集沉淀物；
[0031]4)向步驟3)收集的沉淀物中依次加入800 μ I 55°C預(yù)熱的濃度為0.lmol/L的三羥甲基氨基甲烷堿、2 μ I β -巰基乙醇和6 μ I濃度為20mg/L的蛋白酶K，充分混勻后置于55°C的水浴中加熱lh，浴熱過程中每1min顛倒混勻一次；
[0032]5)向步驟4)制備的混合液中加入800 μ I的水飽和酚，溫和混勻5min，在13000rpm的轉(zhuǎn)速下離心處理3min，取上清液置于第二個2.0ml的離心管中；
[0033]6)向步驟5)制備的上清液中加入與上清液相同體積的酚、氯仿和異戊醇的混合物，其中酚、氯仿與異戊醇的體積比為25:24:1，輕搖萃取5min，室溫下在13000rpm的轉(zhuǎn)速下離心處理3min，取上清液置于第三個2.0ml的離心管中；
[0034]7)向步驟6)制備的上清液中加入與上清液相同體積的酚、氯仿和異戊醇的混合物，其中酚、氯仿與異戊醇的體積比為25:24:1，輕搖萃取5min，室溫下在13000rpm的轉(zhuǎn)速下離心處理3min，取上清液置于第四個2.0ml的離心管中；
[0035]8)向步驟7)制備的上清液中加入與上清液相同體積的氯仿和異戊醇的混合物，其中氯仿與異戊醇的體積比為24:1，輕搖萃取5min，室溫下在13000rpm的轉(zhuǎn)速下離心處理3min，取上清液置于第五個2.0ml的離心管中；
[0036]9)向步驟8)制備的上清液中加入_20°C預(yù)冷的無水乙醇和pH為5.2濃度為3mol/L的醋酸鈉，其中無水乙醇與上清液的體積比為2:1，醋酸鈉與上清液的體積比為1:10，輕搖混勻并在_20°C的溫度下冷凍30min，并于室溫下在1000rpm的轉(zhuǎn)速下離心處理20min，棄上清，收集沉淀物；
[0037]10)向步驟9)收集的沉淀物中加入Iml濃度為75%溫度為40°C預(yù)熱的乙醇，輕搖洗滌沉淀，并于室溫下在1000rpm的轉(zhuǎn)速下離心處理5min，棄上清，收集沉淀物；
[0038]11)在室溫下將步驟10)收集的沉淀物置于通風(fēng)處揮發(fā)乙醇，待沉淀物透明后，向透明溶液中加入50 μ I的超純水或TE溶液，并在4°C的溫度下靜置Ih后即得串珠藻屬淡水紅藻藻體DNA。
[0039]對本實施例提取的串珠藻屬淡水紅藻藻體DNA進行了電泳檢測，檢測結(jié)果如圖1所示，圖中1-1-2，8-9，2-1-9為采用本方法提取的串珠藻屬的DNA樣本，1-3-7采用改良的CTAB法提取的串珠藻屬DNA樣品，檢測結(jié)果顯示采用本方法提取的總DNA純度較高。
[0040]實施例2
[0041]本實施例中所述的一種適用于淡水紅藻DNA的提取方法，包括以下步驟:
[0042]I)取用硅膠干燥后的熊野屬淡水紅藻藻體150mg置于研缽中，向研缽中加入適量液氮，將熊野屬淡水紅藻藻體研磨成粉末；
[0043]2)將研磨好的熊野屬淡水紅藻藻體粉末置于第一個2.0ml的離心管中，并向離心管中加入Iml濃度為lmol/L的葡萄糖溶液，充分混勻后將離心管置于55°C的金屬浴中加熱lh，在浴熱過程中間隔顛倒混勻；
[0044]3)將浴熱混勻后的熊野屬淡水紅藻藻體冷卻至常溫，在5000rpm的轉(zhuǎn)速下離心處理3min，棄上清，收集沉淀物；
[0045]4)向步驟3)收集的沉淀物中依次加入800 μ1 55 °C預(yù)熱的pH為8.0濃度為0.05mol/L的乙二胺四乙酸二鈉水溶液、2 μ?β-巰基乙醇和8 μ I濃度為20mg/L的蛋白酶K，充分混勾后置于55°C的金屬浴中加熱lh，浴熱過程中每1min顛倒混勾一次；
[0046]5)向步驟4)制備的混合液中加入800 μ I的水飽和酚，溫和混勻5min，在13000rpm的