膜表達人pd-1蛋白的穩(wěn)轉(zhuǎn)株細胞構(gòu)建方法
【技術(shù)領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領域，尤其涉及膜表達人ro-1蛋白的穩(wěn)轉(zhuǎn)株細胞構(gòu)建方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 程序性細胞死亡蛋白1(Programmedcelldeathproteinl，以下簡稱ro-l)是 由H)CD1基因也叫CD279基因編碼的蛋白，為免疫球蛋白超家族中的細胞膜蛋白成員之一， 是典型的由268個氨基酸組成的I型膜蛋白。H)-l是⑶28/CTLA4家族中的T細胞調(diào)節(jié)因 子之一，其結(jié)構(gòu)包括一個胞外的IgV結(jié)構(gòu)域，其后緊跟著一個跨膜結(jié)構(gòu)域和一個胞內(nèi)末端。 PD1最初是在凋亡的T細胞雜交瘤中得到的，由于其和細胞凋亡相關(guān)而被命名為程序性死 亡-1受體。pd-li與其t細胞上的受體ro-i相互作用，在免疫應答負調(diào)控方面發(fā)揮著重要 作用，該分子具有廣泛的組織表達譜，在一些腫瘤細胞系上有較高的表達，許多研究均表明 其于腫瘤的免疫逃逸機制相關(guān)。腫瘤部位的微環(huán)境可誘導腫瘤細胞上的ro-Li的表達，且 廣范表達，表達的ro-Ll有利于腫瘤的發(fā)生和生長，誘導抗腫瘤T細胞的凋亡。因此通過阻 斷ro-Li/ro-i信號通路可有效抑制腫瘤生長，可根據(jù)此設計新的對腫瘤免疫逃逸的治療 方案，來加強T細胞對腫瘤的殺傷作用。
[0003] 在抗腫瘤免疫中，通常遵循腫瘤特異性T細胞活化、T細胞增值、腫瘤浸潤和T細 胞記憶應答加強的步驟。研究表明，腫瘤細胞以及腫瘤微環(huán)境中的apcs表達的ro-Li均可 經(jīng)ro-1/PD-Ll信號通路抑制腫瘤抗原特異性T細胞的活化，下調(diào)T細胞介導的腫瘤免疫應 答，干預ro-1/PD-Ll信號有望成為腫瘤免疫治療的新策略。
[0004] 目前，構(gòu)建穩(wěn)定表達細胞系有兩種方法：
[0005] 1)抗生素篩選：該種方法的構(gòu)建穩(wěn)定表達細胞系的基本原理是將外源DNA克隆 到具有某種抗性的載體上，將目標基因構(gòu)建至帶有抗生素篩選標記的質(zhì)粒上，載體在通 過磷酸鈣轉(zhuǎn)染、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染或者電轉(zhuǎn)等方式轉(zhuǎn)染到宿主細胞并整合到宿主染色體中，用 載體所含的抗生素標志進行篩選。最常用的真核表達載體的抗性篩選標志物有新霉素 (neomycin)、潮霉素（hygromycin)和噪呤霉素（puromycin)，用長G418來代替新霉素進行 選擇性篩選，篩選得到可穩(wěn)定表達的目的蛋白的細胞株。但其篩選時間長，且受限于所采用 的轉(zhuǎn)染方式和相應的細胞系，對于某些不能轉(zhuǎn)染長期培養(yǎng)的原代細胞和難轉(zhuǎn)染的細胞將不 適合采用這種方法，且轉(zhuǎn)然效率的高低直接影響整合發(fā)生的概率，而且假陽性發(fā)生率高，細 胞在長期的抗生素培養(yǎng)基中容易產(chǎn)生抗藥性，后續(xù)細胞篩選鑒定工作量大。
[0006] 2)慢病毒感染后篩選：慢病毒（Lentivirus)載體是以HIV-1 (人類免疫缺陷I型 病毒）為基礎發(fā)展起來的基因治療載體，區(qū)別一般的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，它對分裂細胞和非分 裂細胞均具有感染能力。慢病毒載體帶有可進行高效率的包裝、轉(zhuǎn)染并穩(wěn)定整合進靶細胞 的基因組中的序列元件，目的基因參與細胞的基因重組，形成穩(wěn)定遺傳物質(zhì)，使得目的基因 在細胞中可穩(wěn)定長期表達。在感染能力方面可有效地感染神經(jīng)元細胞、肝細胞、心肌細胞、 腫瘤細胞、內(nèi)皮細胞、干細胞等多種類型的細胞，從而達到良好的的基因治療效果。慢病毒 感染細胞后能很快將目的基因隨機整合至基因組中，整合效率高，假陽性少等優(yōu)點。且其篩 選標記物可擴展到各類熒光蛋白標記的非抗生素標記物，如EGFP，RFP，YFP，ZsGreenl等， 在后續(xù)的篩選中可輕易通過流式細胞儀進行識別和篩選，無需加入流式抗體。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于提供一種膜表達人ro-i蛋白的穩(wěn)轉(zhuǎn)株細胞構(gòu)建方法，旨在解 決現(xiàn)有技術(shù)單克隆抗體生產(chǎn)株假陽性發(fā)生率高、親和力不高、單克隆篩選時間長和篩選成 本高的問題。
[0008] 本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的，一種膜表達人ro-i蛋白的穩(wěn)轉(zhuǎn)株細胞構(gòu)建方法，包括如下 步驟：
[0009] 設計含酶切位點EcoRI的引物pLVX-PD-1-F和含酶切位點BamHI的引物 pLVX-PD-1-R，并所述藥物與ro-1的DNA序列進行PCR擴增，收集擴增產(chǎn)物；
[0010] 將慢病毒包裝質(zhì)粒載體pLVX-IRES-ZsGreenl與所述擴增產(chǎn)物分別進行酶切處 理，分別得到pLVX-IRES-ZsGreenl(EcoRI+BamHI)和PD-1 (EcoRI+BamHI)酶切產(chǎn)物；所述 pLVX-IRES-ZsGreenl(EcoRI+BamHI)和PD-1 (EcoRI+BamHI)酶切產(chǎn)物連接后轉(zhuǎn)化處理，將 轉(zhuǎn)化產(chǎn)物擴增后進行質(zhì)粒抽提處理，得到膜表達H)-l的載體pLVX-PD-1-IRES-ZsGreenl;
[0011] 將所述膜表達PD-1的載體pLVX-PD-1-IRES-ZsGreenl與病毒包裝質(zhì)粒pMD2. G和 PsPAX2共轉(zhuǎn)染至真核細胞中，進行病毒包裝，同時對病毒滴度進行監(jiān)控；
[0012] 當病毒滴度以M0I=2-10感染所述真核細胞時，加入終濃度為5-8ug/ml的 polybrene協(xié)助病毒；將感染病毒的所述真核細胞進行正常傳代后，選取熒光陽性細胞進 行分選，并對分選的細胞進行擴增后凍存處理，得到穩(wěn)定表達ro-i的細胞株。本發(fā)明提供 的膜表達人ro-i蛋白的穩(wěn)轉(zhuǎn)株細胞構(gòu)建方法，通過包裝慢病毒再感染真核細胞，經(jīng)熒光篩 選后得到可穩(wěn)定表達ro-1抗原的細胞株。由于該方法中將包裝的慢病毒進一步的感染了 真核細胞，使得其能在單抗研發(fā)過程中通過結(jié)合表面表達的抗原快速篩選到親和力高的 ro-1細胞株；且采用自帶熒光蛋白ZsGreen的載體進而穩(wěn)轉(zhuǎn)株的構(gòu)建，使得在ro-1細胞株 的篩選過程變得更為簡單方便，大量的節(jié)約單克隆篩選時間和篩選成本。
【附圖說明】
[0013] 圖1是本發(fā)明實施例膜表達人ro-1蛋白的穩(wěn)轉(zhuǎn)株細胞構(gòu)建方法流程圖；
[0014] 圖2本發(fā)明實施例提供的ro-1的DNA的PCR擴增產(chǎn)物電泳圖，其中，M表示 Marker，"一"表示陰性對照，1-2為ro-1的DNA的PCR產(chǎn)物；
[0015] 圖3是本發(fā)明實施例提供的pLVX-PD-1-IRES-ZsGreenl載體構(gòu)建酶切鑒定電泳 圖，其中，M表示Marker; 1-4 為pLVX-PD-1-IRES-ZsGreenl單克隆EcoRI+BamHI雙酶切；
[0016] 圖4是本發(fā)明實施例提供的蛋白表達鑒定中的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞熒光圖；
[0017] 圖5是本發(fā)明實施例提供的WesternBlot蛋白表達圖，其中，1為293T細胞胞液， 2為293T細胞膜抽提液，3為ZsGreen細胞胞液；4為ZsGreen細胞膜抽提液，5為H)-l細 胞胞液；6為ro-i細胞膜抽提液；
[0018] 圖6是本發(fā)明實施例提供的病毒包裝時細胞轉(zhuǎn)染熒光圖；
[0019] 圖7是本發(fā)明實施例提供的病毒滴度測定時的病毒感染熒光圖，其中，a為5iU病 毒感染英冠圖，b為0. 5ii1病毒感染突光圖；
[0020]圖8是本發(fā)明實施例提供的毒滴度分析流式圖，其中，a為5iU病毒感染孔的毒 滴度分析流式圖，b為0. 5ii1病毒感染孔的毒滴度分析流式圖；
[0021]圖9是本發(fā)明實施例提供的穩(wěn)轉(zhuǎn)株細胞構(gòu)建時的病毒感染熒光圖；
[0022] 圖10是本發(fā)明實施例提供的穩(wěn)定表達細胞株分選流式圖。
【具體實施方式】
[0023] 為了使本發(fā)明要解決的技術(shù)問題、技術(shù)方案及有益效果更加清楚明白，以下結(jié)合 附圖及實施例，對本發(fā)明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用 以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0024] 本發(fā)明實施例提供了一種膜表達人ro-i蛋白的穩(wěn)轉(zhuǎn)株細胞構(gòu)建方法，包括如下 步驟，如圖1所示：
[0025] S01?構(gòu)建載體pLVX-PD-1-IRES-ZsGreenl :設計含酶切位點EcoRI的引物 pLVX-PD-1-F和含酶切位點BamHI的引物pLVX-PD-1-R，并所述藥物