一種預(yù)示和鑒定西瓜果肉顏色的分子標(biāo)記MboII-33及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種預(yù)示和鑒定西瓜果肉顏色的分子標(biāo)記MboII-33及應(yīng)用，屬于分 子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 分子標(biāo)記輔助選擇是隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展而產(chǎn)生的新技術(shù)，它可 以從分子水平上快速準(zhǔn)確地分析個(gè)體的遺傳組成，從而實(shí)現(xiàn)對基因型的直接選擇，進(jìn)行分 子育種。分子標(biāo)記輔助選擇成功的關(guān)鍵在于所獲得的分子標(biāo)記是否與待分析的性狀相連鎖 以及是否在同一物種的不同材料間具有通用性。
[0003] 西瓜的果肉顏色是西瓜品質(zhì)構(gòu)成的一項(xiàng)重要指標(biāo)，西瓜果實(shí)中含有番茄紅 素、胡蘿卜素、葉黃素、玉米黃質(zhì)等多種色素，不同色素的組成及含量的多少使西 瓜果肉呈現(xiàn)出不同顏色。同時(shí)，西瓜果肉中的色素也具有對人體有益的生理功能， 有研宄表明，番茄紅素具有高效的抗氧化活性，能有效的降低癌癥和心腦血管的發(fā) 病率，并可以作為一種功能性色素廣泛的應(yīng)用于功能食品、藥品和化妝品中（Sahin K,TuzcuM,SahinN,etal.Nrf2/H〇-lsignalingpathwaymaybetheprimetarget forchemopreventionofcisplatin-inducednephrotoxicitybylycopene.Food ChemToxicol, 2010, 48(10):2670-2674；MortensenA,SkibstedLH,SampsonJ,et al.Comparativemechanismsandratesoffreeradicalscavengingbycarotenoid antioxidants.FEBSLett, 1997,418(12):91-97)。0-胡蘿卜素可以減少脂質(zhì)過氧化保護(hù) 有機(jī)體不被破壞（OlsonJA.Molecularactionsofcarotenoids.In:CanfieldLM(ed). CarotenoidsinHumanHealth,NewYork.AcademyofSciences, 1993. 156-166)，葉黃素 對維護(hù)視力有著重要的作用。因此通過分子標(biāo)記輔助選擇的方法高效的選育不同果肉顏色 的西瓜品種是當(dāng)前西瓜育種工作的主要部分。
[0004] 隨著DNA分子標(biāo)記技術(shù)的快速發(fā)展，利用與植物相關(guān)基因緊密連鎖的分子標(biāo)記進(jìn) 行輔助選擇，可以極大的加速主要性狀的篩選和基因定位，從而大大提高育種選擇效率。但 是，西瓜的遺傳距離較為狹窄，目前文獻(xiàn)已公布的可用的分子標(biāo)記數(shù)目較少且多態(tài)性較低， 嚴(yán)重制約了西瓜主要農(nóng)藝性狀基因定位及相關(guān)分子標(biāo)記的開發(fā)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為提供一個(gè)CAPS分子標(biāo)記，用以對含有番前紅素和不含有番前紅素的西瓜植株 進(jìn)行分子標(biāo)記輔助選擇，本發(fā)明采取了以下技術(shù)方案：
[0006] 本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種預(yù)示和鑒定西瓜果肉顏色的分子標(biāo)記Mb〇II-33， 該分子標(biāo)記擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物片段大小為524bp，核苷酸序列如SEQIDNO. 1所示。。
[0007] 所述分子標(biāo)記位于西瓜番茄紅素e-環(huán)化酶cds區(qū)段，該區(qū)段的GenBank登錄號 為ABM90917. 1，與西瓜番茄紅素0-環(huán)化酶基因緊密連鎖。
[0008] 所述分子標(biāo)記的鑒別引物對正向引物的核苷酸序列如SEQIDNO. 2所示，反向引 物的核苷酸序列如SEQIDNO. 3所示。
[0009] 所述分子標(biāo)記Mb〇II-33應(yīng)用于鑒定和輔助篩選西瓜的果肉顏色。
[0010] 所述應(yīng)用是提取待測樣品的DNA后，利用鑒別引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再利用限制性 內(nèi)切酶對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切，最后利用電泳對酶切產(chǎn)物進(jìn)行檢測。
[0011] 所述應(yīng)用的步驟如下：
[0012] 1)提取待測樣品的DNA;
[0013] 2)以待測樣品的DNA為模板，利用鑒別引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得擴(kuò)增產(chǎn)物；
[0014] 3)利用限制性內(nèi)切酶對步驟2)所得的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切，獲得酶切產(chǎn)物；
[0015] 4)利用瓊脂糖凝膠電泳對步驟3)所得的酶切產(chǎn)物進(jìn)行檢測。
[0016] 步驟2)所述鑒別引物對，正向引物的核苷酸序列如SEQIDNO. 2所示，反向引物 的核苷酸序列如SEQIDNO. 3所示。
[0017] 優(yōu)選地，步驟2)所述PCR擴(kuò)增，采用降落PCR，擴(kuò)增程序?yàn)椋?4°C預(yù)變性7min，94°C 變性30s，60 °C退火30s，每循環(huán)降低0. 5 °C，72 °C延伸40s，30個(gè)循環(huán)；94°C變性30s，45 °C退 火30s，72°C延伸40s，10個(gè)循環(huán)；72°C延伸10min，4°C保存。
[0018] 優(yōu)選地，步驟4)所述對酶切產(chǎn)物進(jìn)行檢測，是利用瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切后的 產(chǎn)物中是否含有大小為524bp的條帶，含有524bp條帶的樣品，不含有番茄紅素，果肉顏色 為非紅色；不含有524bp條帶的樣品，含有番茄紅素，果肉顏色為紅色。
[0019] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種所述分子標(biāo)記Mb〇II-33的獲得方法，該方法的 步驟如下：
[0020] 1)選擇一個(gè)淺黃色西瓜品系和一個(gè)紅色西瓜品系；
[0021] 2)利用高通量測序技術(shù)對步驟1)所選的兩個(gè)品系的西瓜進(jìn)行測序，并將所得 序列與西瓜番茄紅素環(huán)化酶基因cds區(qū)段的序列進(jìn)行比對，獲得存在西瓜番茄紅素 0-環(huán)化酶基因cds區(qū)段的序列的染色體區(qū)間；
[0022] 3)在步驟2)所得染色體區(qū)間內(nèi)查找存在SNP突變的堿基區(qū)段，并分析SNP位點(diǎn)的 酶切信息，獲得存在CAPS突變的序列；
[0023] 4)針對步驟3)所得的序列，設(shè)計(jì)引物；
[0024] 5)利用步驟4)所得的引物以西瓜基因組DNA為模板進(jìn)行TD-PCR擴(kuò)增，獲得擴(kuò)增 產(chǎn)物；
[0025] 6)利用限制性內(nèi)切酶對步驟5)所得的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切驗(yàn)證。
[0026] 本發(fā)明利用CAPS分子標(biāo)記引物通過PCR擴(kuò)增獲得與西瓜果肉顏色相關(guān)的DNA片 段，再利用限制性內(nèi)切酶對獲得的片段進(jìn)行酶切反應(yīng)，由于兩種不同顏色的西瓜材料在所 獲得的DNA片段中存在酶切位點(diǎn)的單堿基突變的差異。因此，存在單堿基突變的位點(diǎn)不會(huì) 被限制性內(nèi)切酶切開而獲得一條大小為524bp的片段，不存在堿基突變位點(diǎn)的片段會(huì)被限 制性內(nèi)切酶切開，由于在該序列的166bp和510bp處均存在酶切位點(diǎn)，因此經(jīng)兩個(gè)位點(diǎn)酶切 后，最終獲得344bp(401-57)及123bp的兩個(gè)片段，通過瓊脂糖凝膠電泳可以清晰的將兩中 不同果肉顏色的西瓜材料進(jìn)行區(qū)分。
[0027] 本發(fā)明獲得的CAPS分子標(biāo)記，在不同的果肉顏色的西瓜材料中可以進(jìn)行很好的 區(qū)分，通過對分子標(biāo)記所在染色體附近序列進(jìn)行Blast比對的結(jié)果可知，該標(biāo)記與西瓜番 茄紅素e-環(huán)化酶緊密連鎖，因此，本發(fā)明獲得了一個(gè)可以高效區(qū)分不同西瓜果肉番茄紅 色有無的分子標(biāo)記，為今后西瓜番茄紅素相關(guān)主效基因的定位奠定基礎(chǔ)。
[0028] 本發(fā)明獲得的有益效果如下：
[0029]CAPS分子標(biāo)記是以酶切位點(diǎn)單堿基突