基于芽變的蘋果選種的方法
【專利說明】基于芽變的蘋果選種的方法
[0001] 一、技術(shù)領(lǐng)域 本發(fā)明涉及一種蘋果選種的方法，尤其是一種基于芽變的蘋果選種的方法。
[0002] 二、【背景技術(shù)】 蘋果作為一種重要的水果，被人們廣泛地食用，大量的蘋果都是來自芽變品種生產(chǎn)的， 因此基于芽變的蘋果選種的方法是蘋果育種的一種重要方法，在現(xiàn)有的基于芽變的蘋果選 種的方法中，對疑似變異材料必須經(jīng)過高接鑒定，以確定變異材料為芽變，才能剔除飾變材 料，蘋果選種的過程耗時長，占地多，工作量大，消耗大量的人力、財力、物力，對實驗條件和 人員要求高，且受自然環(huán)境影響大，選種難度大，育種效率低。
[0003] 三、
【發(fā)明內(nèi)容】
為了克服上述技術(shù)缺點，本發(fā)明的目的是提供一種基于芽變的蘋果選種的方法，因此 縮短了蘋果選種的選育周期，提高了新蘋果選種的準(zhǔn)確性。
[0004] 為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：其步驟是：通過SSAP分子鑒定方法 對發(fā)現(xiàn)的疑似芽變樣本確定是芽變樣本、還是飾變樣本，對芽變樣本進(jìn)行芽變資源擴(kuò)繁得 到品種體系，對得到的品種體系進(jìn)行果實質(zhì)量和經(jīng)濟(jì)性狀評價，確定芽變樣本是否為新品 種。
[0005] 由于設(shè)計了SSAP分子鑒定方法，通過對蘋果的疑似芽變樣本進(jìn)行SSAP分子鑒定 方法分析，直接確定是芽變樣本和還是飾變樣本，不再通過種植嫁接把疑似芽變樣本確定 是芽變樣本和還是飾變樣本，因此縮短了蘋果選種的選育周期，提高了新蘋果選種的準(zhǔn)確 性。
[0006] 本發(fā)明設(shè)計了，其步驟是： a、 初選 發(fā)掘變異：蘋果園中發(fā)掘疑似芽變樣本并且選好對照樣本，對疑似芽變樣本和對照樣 本進(jìn)行登記編號并且作出明顯區(qū)別的標(biāo)記； 分析變異：通過SSAP分子鑒定方法對疑似芽變樣本和對照樣本進(jìn)行分析，確定變異樣 本是芽變樣本或飾變樣本； b、 復(fù)選 芽變資源擴(kuò)繁：把芽變樣本和對照樣本分別嫁接到矮化蘋果砧上，再定植到選種圃中 進(jìn)行培育； 品系評價：對選種圃中的嫁接在矮化蘋果砧上的芽變樣本和對照樣本的每一株進(jìn)行建 立檔案并且分別觀察，連續(xù)進(jìn)行至少三年的觀察記錄，當(dāng)嫁接在矮化蘋果砧上的芽變樣本 和對照樣本盛產(chǎn)果實后，至少連續(xù)三年，對果實和其它重要經(jīng)濟(jì)性狀進(jìn)行全面分析鑒定，確 定芽變樣本是否為最優(yōu)良的品系并且定為入選品系樣本，把入選品系樣本在不同生態(tài)環(huán)境 條件地區(qū)進(jìn)行多點試驗栽植，再對果實和其它重要經(jīng)濟(jì)性狀進(jìn)行全面分析鑒定。
[0007] c、決選 根據(jù)入選品系樣本的選種歷史、分析鑒定結(jié)果和發(fā)展前景；即：入選品系樣本在選種 圃內(nèi)連續(xù)三年以上果樹學(xué)與農(nóng)業(yè)生物學(xué)的完整鑒定數(shù)據(jù)、在不同生態(tài)條件下的試驗結(jié)果和 有關(guān)鑒定意見、及結(jié)對照的新鮮果實和經(jīng)審查鑒定后確定該品系在生產(chǎn)上有發(fā)展前途，把 入選品系樣本進(jìn)行命名。
[0008]本發(fā)明設(shè)計了，SSAP分子鑒定方法： 對疑似芽變樣本和親本對照樣本采集嫩葉，提取基因組DNA，將基因組DNA進(jìn)行酶切， 然后加上酶切接頭，再經(jīng)過預(yù)擴(kuò)增和選擇性擴(kuò)增，PCR終產(chǎn)物由6%聚丙烯酰胺變性膠電泳 分離，銀染顯色，根據(jù)條帶有無差異，確定是否為芽變。
[0009] 本發(fā)明設(shè)計了，所述的基因組DNA提取方法如下： 一、DNA試樣的制取 a、 將0.1g的疑似芽變樣本和親本對照樣本采集嫩葉分別在液氮中研碎后移入1.5mL 離心管I中； b、 在離心管I中加入600yL溫度為65°C的CTAB后提取緩沖液；CTAB是指2%CTAB; 100mMTris-HCl，pH8. 0 ;20mMEDTA，pH8. 0 ;1. 4MNaCl;使用前加入 0? 4% 3 -巰基乙 醇； c、 將緩沖液放到離心管II中，把離心管II在65°C保溫箱中保溫30min，期間顛倒幾次， 再加入600yL的v/v=24/l的氯仿/異戊醇，輕輕顛倒，5min，在轉(zhuǎn)速為10000r/min的 離心機中進(jìn)行離心運動10min; d、 把離心管II的500iiL的上清液移入到離心管III，在離心管III中加入加入600iiL 的v/v=24/l的氯仿/異戊醇，輕輕顛倒若干次，在轉(zhuǎn)速為10000r/min的離心機中進(jìn)行離 心運動10min; e、 把離心管III的300iiL的上清液移入到離心管IV，在離心管IV中加入二倍體積預(yù)冷 的的無水乙醇，顛倒混勻； f、 把離心管IV中的沉淀物，放到含350yLTE緩沖液的1.5mL離心管V中，當(dāng)沉淀溶 解后，在轉(zhuǎn)速為10000r/min的離心機中進(jìn)行離心運動10min; g、 把離心管V的300yL的上清液移入到離心管VI，在離心管VI中加入1yL的10 Ug/UL的RNase，輕輕混勻后在37°C水浴1h，冷卻至室溫，再加入1/10體積的pH5. 2的 3MNaAc，混勻后再加入二倍體積預(yù)冷的無水乙醇，顛倒混勻，在溫度為-20°C的保溫箱中 靜置30min,在轉(zhuǎn)速為10000r/min的離心機中進(jìn)行離心運動10min; h、 對離心管VI中的沉淀物，進(jìn)行至少兩次的使用70%乙醇洗滌并且使用離心運動進(jìn)行 沉淀；在超凈工作臺上對沉淀物進(jìn)行風(fēng)干，加入100ULTE溶解沉淀物得到DNA試樣。
[0010] 二、DNA試樣的酶切 采用feoRI和i&el兩種限制性內(nèi)切酶對DNA試樣進(jìn)行酶切，反應(yīng)體系如下：
【主權(quán)項】
1. 一種基于芽變的蘋果選種的方法；其特征是：其步驟是：通過SSAP分子鑒定方法對 發(fā)現(xiàn)的疑似芽變樣本確定是芽變樣本、還是飾變樣本，對芽變樣本進(jìn)行芽變資源擴(kuò)繁得到 品種體系，對得到的品種體系進(jìn)行果實質(zhì)量和經(jīng)濟(jì)性狀評價，確定芽變樣本是否為新品種。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于芽變的蘋果選種的方法；其特征是：其步驟是： 初選 發(fā)掘變異：蘋果園中發(fā)掘疑似芽變樣本并且選好對照樣本，對疑似芽變樣本和對照樣 本進(jìn)行登記編號并且作出明顯區(qū)別的標(biāo)記； 分析變異：通過SSAP分子鑒定方法對疑似芽變樣本和對照樣本進(jìn)行分析，確定變異樣 本是芽變樣本或飾變樣本； b、復(fù)選 芽變資源擴(kuò)繁：把芽變樣本和對照樣本分別嫁接到矮化蘋果砧上，再定植到選種圃中 進(jìn)行培育； 品系評價：對選種圃中的嫁接在矮化蘋果砧上的芽變樣本和對照樣本的每一株進(jìn)行建 立檔案并且分別觀察，連續(xù)進(jìn)行至少三年的觀察記錄，當(dāng)嫁接在矮化蘋果砧上的芽變樣本 和對照樣本盛產(chǎn)果實后，至少連續(xù)三年，對果實和其它重要經(jīng)濟(jì)性狀進(jìn)行全面分析鑒定，確 定芽變樣本是否為最優(yōu)良的品系并且定為入選品系樣本，把入選品系樣本在不同生態(tài)環(huán)境 條件地區(qū)進(jìn)行多點試驗栽植，再對果實和其它重要經(jīng)濟(jì)性狀進(jìn)行全面分析