快速鑒定西瓜新品種紅和平雜交種子純度的方法以及采用的引物和試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及快速檢測(cè)西瓜新品種'紅和平'雜交種子純度 的方法以及采用的引物和試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 西瓜新品種【Citrulluslanatus(Thunb. )Matsum. &Nakai】是一種重要的經(jīng)濟(jì)作 物。我國每年西瓜新品種種植面積約為1. 73X106hm2,總產(chǎn)量約為6. 28X107t，面積和產(chǎn)量 分別占世界的54%和60%以上，均居世界第一位。因此，西瓜新品種種子純度對(duì)種植者來 說是必需保證的。
[0003] 西瓜新品種雜交種制種的過程中，母本和父本分別種植在不同的區(qū)域，雌花開花 前，把母本上所有的雄花都去除。開花期用父本的花粉授到母本的雌花柱頭上，從而產(chǎn)生雜 交種。如果母本上的雄花去除不徹底，花粉就可能落到雌花柱頭上產(chǎn)生自交種，出現(xiàn)雜種。 因此，雜交種必需進(jìn)行種子純度鑒定。
[0004] 傳統(tǒng)的西瓜新品種種子純度鑒定主要是通過將雜交種種植后對(duì)其進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒 定。西瓜新品種的全生育期需要80~100天，漫長的生長周期易受環(huán)境影響。某些易受環(huán) 境影響的性狀就會(huì)難以判定，所以需要對(duì)其品種特性極其了解的專業(yè)育種者。這些都使得 鑒定過程受到了極大的限定。為了解決傳統(tǒng)鑒定困難的問題，農(nóng)業(yè)工作者進(jìn)行了研宄，其中 黃永紅等采用同工酶的方法檢測(cè)西甜瓜種子純度，張國良采用葉形進(jìn)行鑒定。但前者仍需 要15-20天的時(shí)間，后者不能鑒別葉形相同的親本且對(duì)種植環(huán)境要求苛刻。
[0005] 隨著分子標(biāo)記的快速發(fā)展，將分子標(biāo)記應(yīng)用到其中將加速種子純度的鑒定過程， 而且鑒定過程不需要特定的育種家。分子標(biāo)記對(duì)種子純度的鑒定主要是依據(jù)父母本及雜交 一代中的遺傳信息存在多樣性，因此鑒定過程包括分子標(biāo)記所需引物的開發(fā)，DNA的提取， 篩選等等。西瓜新品種基因組測(cè)序的完成，為采用分子標(biāo)記進(jìn)行種子純度鑒定提供了可能。 發(fā)明基于SSR分子標(biāo)記技術(shù)的種子純度檢測(cè)方法，將對(duì)規(guī)范西瓜新品種種子產(chǎn)業(yè)，保護(hù)育 種者的合法權(quán)益及種植戶的切身利益等都有重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明針對(duì)目前西瓜新品種種子純度鑒定大多靠田間表型觀察的方法、存在受季 節(jié)限制大，鑒定所需時(shí)間長等缺陷，本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供了一種不依賴季節(jié)、快速、 準(zhǔn)確、低成本檢測(cè)西瓜新品種"紅和平"種子純度的方法。本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供了上 述方法采用的引物。本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供了上述方法采用的試劑盒。
[0007]為了實(shí)現(xiàn)上述第一個(gè)目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：
[0008] 西瓜新品種'紅和平'種子純度的鑒定方法，該方法包括以下步驟：
[0009] 1)西瓜新品種基因組SSR引物的開發(fā)：根據(jù)公布的西瓜新品種基因組序列進(jìn)行全 序列的下載，使用Mr印s2. 5SSR序列鑒定程序，鑒定DNA序列上含SSR的序列區(qū)段，設(shè)計(jì)出 跨越SSR位點(diǎn)的PCR引物；
[0010] 2)單粒西瓜新品種種仁基因組DNA提?。好子肧DS法提取西瓜新品種種仁基因組 DNA;對(duì)提取的DNA樣品進(jìn)彳丁評(píng)估；
[0011] 3)PCR反應(yīng)體系及程序：在200y1PCR管中加入基因組DNA50ng、 10pm〇l/yl引物各lyl，該引物由上游引物和下游引物，所述的上游引物的序列為 5 ' -CCAAGAAACGAGAAATTCGC-3 '和下游引物 5 ' -GCAAGCTCCTCCATAAACCC-3 '，12. 5y1 混合液，混合液包括10XBuffer、dNTP、Mg2+、TaqDNA聚合酶，滅菌雙蒸水補(bǔ)充到25y1，同時(shí) 設(shè)置空白對(duì)照實(shí)驗(yàn)，空白對(duì)照實(shí)驗(yàn)以無菌水代替基因組DNA;混勻后置于PCR反應(yīng)儀上進(jìn)行 擴(kuò)增，PCR反應(yīng)程序：94°C預(yù)變性3min;94°C變性30s，56°C退火30s，72°C延伸60s，共40個(gè) 循環(huán)；最后72°C延伸7min;4°C保存；
[0012] 4)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳分析：將擴(kuò)增產(chǎn)物采用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn) 行電泳分離，在擴(kuò)增產(chǎn)物中加入上樣緩沖液，上樣于經(jīng)30分鐘預(yù)電泳的變性聚丙烯酰胺凝 膠上，70W恒功率電泳至溴酚藍(lán)剛剛到達(dá)凝膠的另一端，凝膠經(jīng)硝酸銀染色后再可見光下觀 察、照相；將PHF/PHR引物的親本和F1電泳圖繪制成標(biāo)準(zhǔn)圖譜；
[0013] 5)待測(cè)樣品種子純度鑒定利用PHF/PHR引物，將待測(cè)樣品種子按上述步驟制備出 指紋圖譜后，再分別與'紅和平'品種標(biāo)準(zhǔn)圖譜進(jìn)行比對(duì)；如果相同，即可確定為'紅和平' 雜交種，否則為雜種；種子純度按以下公式計(jì)算：
[0014] 種子純度=(檢測(cè)所得真種子數(shù)/檢測(cè)種子總數(shù)）X100%。
[0015] 作為優(yōu)選，所述的步驟2)提取西瓜新品種種仁基因組DNA的方法如下：在1. 5ml 離心管中加入200y1SDS的提取緩沖液；取1粒種子，去除種殼后放入上述緩沖液，研磨呈 糊狀，用600y1SDS提取緩沖液沖洗玻璃棒；顛倒混勻后65°C水浴15min，短暫離心；加入 500y1氯仿：異戊醇=24 :1混合液，翻轉(zhuǎn)混勻，12,OOOrpm離心5min，將上清轉(zhuǎn)入一新的 1. 5ml的離心管中；加入500y1氯仿，翻轉(zhuǎn)混勾，12,OOOrpm離心5min，將上清轉(zhuǎn)入一新的 1. 5ml的離心管中；加入2. 5倍體積的無水乙醇，緩慢翻轉(zhuǎn)，靜置5min，10,OOOrpm，室溫離心 5min，棄上清；于沉淀中加入lml70%的乙醇洗絳，12,OOOrpm離心2min。倒掉上清液，通 風(fēng)干燥；加入25y1含有1y1 10mg/mlRNaseA的TE緩沖液溶解，37°C溫育30min，-20°C 保存。
[0016] 作為優(yōu)選，所述的步驟2)根據(jù)西瓜新品種action基因設(shè)計(jì)引物，W_actinF:5'>A ATGTGCCTGCTATGTATGTCG〈3' ；W-actinR:5' >GATGGAGTTGTAGGTAGTITCG〈3' ；對(duì)提取的DNA樣 品進(jìn)彳丁評(píng)估。
[0017] 為了實(shí)現(xiàn)上述第二個(gè)目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：
[0018] 一種用于檢測(cè)西瓜新品種'紅和平'雜交種純度的引物，該引物由上游引物和 下游引物，所述的上游引物的序列為V-CCAAGAAACGAGAAATTCGC-3 ^和下游引物V -GCAAGCTCCTCCATAAACCC-3 ' 〇
[0019] 為了實(shí)現(xiàn)上述第三個(gè)目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：
[0020] 一種用于檢測(cè)西瓜新品種品種"紅和平"種子純度的試劑盒，該試劑盒包括盒體 和7支PCR管及標(biāo)準(zhǔn)圖譜照片；其中，在5支PCR管中分別裝有MgCl2,dNTP，lOXBuffer， Taq聚合酶及1oadingbuffer，在另外2支PCR管中分別裝有鑒定"紅和平"西瓜新品 種種子純度的引物：上游引物的序列為5 ' -CCAAGAAACGAGAAATTCGC-3 ^和下游引物 5 ' -GCAAGCTCCTCCATAAACCC-3 ' 〇
[0021] 本發(fā)明由于采用了上述的技術(shù)方案，本發(fā)明的優(yōu)勢(shì)：
[0022] 1、快速高效，該方法檢測(cè)過程僅需要1-2天，且不受環(huán)境的限制；
[0023] 2、準(zhǔn)確性高：基因組DNA不受環(huán)境的影響，避免了田間表型鑒定因?yàn)榄h(huán)境影響帶 來的誤差；
[0024] 3、操作簡單：本方法所需的設(shè)備和試劑都是常規(guī)實(shí)驗(yàn)室擁有的，簡便易行；
[0025] 4、成本低廉：該方法避免了種植西瓜新品種所需的各種設(shè)備及管理，節(jié)省了大量 的人工、土地和物力。
[0026] 本發(fā)明相比于傳統(tǒng)田間鑒定（需要80~100天），該方法僅需1~2天，且具有不 依賴季節(jié)、快速、準(zhǔn)確、低成本等優(yōu)點(diǎn)，能夠替代傳統(tǒng)西瓜新品種雜交種鑒定方法。本發(fā)明可 在'紅和平'的制種、繁種、經(jīng)銷企業(yè)推廣應(yīng)用。
【附圖說明】
[0027] 圖1為提取的西瓜新品種種仁基因組DNA1 %瓊脂糖凝|父電泳和染色不意圖； M:markerl:水 2-5 :種仁DNA。
[0028] 圖 2 為利用引物W-actinF:5' >AATGTGCCTGCTATGTATGTCG〈3' ；W-actinR:5'>GATG GAGirGTAGGTAGITTCG〈3' ；對(duì)提取的基因組DNA進(jìn)行檢測(cè)的電泳圖；1:marker1-5 :種子6 : 水。
[0029]圖 3 為利用引物PHF:5 ' -CCAAGAAACGAGAAAITCGC-3 '和下游引物 5 ^ -GCAAGCTCCTCCATAAACCC-3 ^ ;獲得的凝膠圖譜；M:marker;P1 :母本；P2 :父本；1-5 : 雜交F1代。
[0030] 圖4為待測(cè)樣品種子制備出指紋圖譜。
【具體實(shí)施方式】
[0031] 下面結(jié)合實(shí)例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。
[0032] 材料說明："紅和平"（浙審瓜2013003)系浙江省農(nóng)科院蔬菜所選育的設(shè)施西瓜新 品種。全生育期l〇〇d左右，果實(shí)發(fā)育期30d。果實(shí)圓球形，果面綠，覆深綠齒條帶，有蠟粉； 果肉大紅色，中心可溶性固形物含量11 %~12%，肉質(zhì)致密，口感好；單瓜質(zhì)量4~5kg，果 皮韌，耐貯運(yùn)；易坐瓜，耐低溫，中抗枯萎病，產(chǎn)量42t?hm-2左右，商品率高。
[0033] 實(shí)施例1用于西瓜新品種'紅和平'種子純度鑒定開發(fā)的SSR引物：
[0034] 首先，根據(jù)公布的西瓜新品種基因組序列（www.icugi.org/)進(jìn)行全序列的下載。 隨后