一種遲發(fā)性耳聾基因多通道熒光pcr檢測(cè)試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種遲發(fā)性耳聾基因多通道熒光PCR檢測(cè)試 劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 耳聾是臨床常見的殘疾疾病之一，在臨床上根據(jù)聽覺系統(tǒng)所受影響的性質(zhì)、原因 和病變部位可將耳聾分為三類：傳導(dǎo)性耳聾（外耳或中耳病變）、感音神經(jīng)性耳聾（內(nèi)耳病 變）、混合性耳聾。研宄資料顯示感音神經(jīng)性耳聾、混合性耳聾與遺傳密切相關(guān)，由遺傳導(dǎo)致 的耳聾約占耳聾的60%以上。
[0003] 遲發(fā)性耳聾患者因攜帶PDS基因，成長過程中在誘發(fā)因素（頭外傷、劇烈運(yùn)動(dòng)、 感冒等）的刺激下，可發(fā)展成重度耳聾或全聾。遲發(fā)性耳聾的遺傳方式為常染色體隱性 遺傳，導(dǎo)致耳聾突變的基因?yàn)镻DS基因，IVS7-2A>G、2168A>G、1174A>T、1229C>T、1226G>A、 1975G>C、2027DA是PDS基因常見的突變位點(diǎn)，占PDS基因所有突變的70%左右。在正常 人群中攜帶率為1-2%，耳聾人群中檢出率為10-15%。
[0004]PDS是常見致聾基因之一，由其突變導(dǎo)致的前庭水管擴(kuò)大是最常見的內(nèi)耳畸形。PDS基因位于7號(hào)染色體長臂22號(hào)區(qū)-31號(hào)區(qū)，突變導(dǎo)致內(nèi)淋巴囊的高滲液經(jīng)擴(kuò)大的前庭 導(dǎo)水管并通過連合管返流到蝸管的基底回和前庭，從而損傷感覺神經(jīng)上皮細(xì)胞，當(dāng)輕微的 頭顱外傷或任何引起顱內(nèi)壓增高的原因使顱內(nèi)壓力波動(dòng)經(jīng)擴(kuò)大的EVA傳至內(nèi)耳，膜迷路破 裂使內(nèi)外淋巴液混合產(chǎn)生突聾、耳鳴、眩暈。臨床主要表現(xiàn)為大前庭水管綜合癥，俗稱"一巴 掌致聾"。通過對(duì)PDS基因常見突變位點(diǎn)檢測(cè)，可避免和有效延緩耳聾的發(fā)生。
[0005] 隨著基因檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展以及對(duì)聽力健康的關(guān)注，目前市場(chǎng)上檢測(cè)耳聾的試劑盒 所用的方法主要有基因芯片法、溶解曲線法、ARMS-PCR法、RFLP法。芯片法一般需要提取、 PCR擴(kuò)增、雜交、洗滌、掃描等步驟，操作較復(fù)雜耗時(shí)長，對(duì)操作者和實(shí)驗(yàn)場(chǎng)地要求較高。溶解 曲線法對(duì)儀器的溫控性要求很高，要求儀器具有高分辨率溶解曲線分析（HRM)功能，而我 們常用的ABI系列熒光定量PCR儀一般缺少此功能。ARMS-PCR法和RFLP法需要對(duì)PCR產(chǎn) 物進(jìn)行電泳分析，不適于臨床應(yīng)用。
[0006] 中國專利"熒光PCR技術(shù)檢測(cè)PDS基因IVS7-2A>G突變的方法及其試劑 盒"（CN104120167A)公開了一種采用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)耳聾基因PDS基因IVS7-2A>G 突變的方法及試劑盒，但該試劑盒一個(gè)PCR反應(yīng)管僅能檢測(cè)耳聾基因PDS上的一個(gè)突變位 點(diǎn)，無法檢測(cè)具有較高突變率的2168A>G、1229C>T、1174A>T等其它位點(diǎn)，從而降低了遲發(fā) 性耳聾篩查覆蓋率。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，本發(fā)明的目的是提供一種遲發(fā)性耳聾基因多通道 熒光PCR檢測(cè)試劑盒，該試劑盒能專一地檢測(cè)遲發(fā)性耳聾中常見的七個(gè)位點(diǎn)，一個(gè)PCR反應(yīng) 管內(nèi)可對(duì)這七個(gè)位點(diǎn)同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，明確高突變率位點(diǎn)的類別，確定低突變率位點(diǎn)范圍，且 操作簡(jiǎn)便快捷，結(jié)果客觀可控性強(qiáng)，效率高、成本低，閉管操作防污染，適用多通道熒光PCR儀，是臨床上進(jìn)行遲發(fā)性耳聾檢測(cè)的強(qiáng)有力產(chǎn)品。
[0008] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案：
[0009] 一種遲發(fā)性耳聾基因多通道熒光PCR檢測(cè)試劑盒，以PDS基因的IVS7-2A>G、 2168A>G、1174A>T、1229C>T、1226G>A、1975G>C、2027DA突變?yōu)闄z測(cè)對(duì)象，設(shè)計(jì)特異性引 物和探針，所述特異性引物包括用于擴(kuò)增IVS7-2A>G的引物1，其序列如序列表中SEQID 勵(lì)：1和5￡〇10勵(lì):2所示；用于擴(kuò)增21684>6的引物2，其序列如序列表中5￡〇10勵(lì):3和 SEQIDN0:4所示；用于擴(kuò)增1174A>T、1229C>T、1226G>A的引物3,其序列如序列表中SEQ IDNO:5和SEQID勵(lì):6所示；用于擴(kuò)增19756>(：、20271^的引物4，其序列如序列表中5￡0 IDNO:7和SEQIDNO:8所示；所述探針為特異性檢測(cè)TOS基因的IVS7-2、2168、1174、1229、 1226、1975、2027位點(diǎn)是否含有突變，其探針序列分別如序列表中SEQIDNO:9至SEQID NO: 15所示。
[0010] 具體的，由于IVS7-2和2168位于PDS基因不同的外顯子上，距離較遠(yuǎn)，故分別設(shè) 計(jì)引物，IVS7-2位點(diǎn)引物（引物1)位置選在IVS7-2位點(diǎn)兩側(cè)翼的保守區(qū)，擴(kuò)增片段長度 為142bp;2168位點(diǎn)引物（引物2)位置選在2168位點(diǎn)兩側(cè)翼的保守區(qū)，擴(kuò)增片段長度為 117bp;1174、1229、1226三個(gè)位點(diǎn)在PDS基因上的距離相近，故共用一對(duì)引物（引物3)，以 避免引物過多造成干擾，正向引物選在1174位點(diǎn)上游保守區(qū)，反向引物選在1229位點(diǎn)下游 保守區(qū)，擴(kuò)增片段長度為250bp;1975、2027兩個(gè)位點(diǎn)在TOS基因上的距離相近，故共用一對(duì) 引物（引物4)，正向引物選在1975位點(diǎn)上游保守區(qū)，反向引物選在2027位點(diǎn)下游保守區(qū)， 擴(kuò)增片段長度為224bp。所述引物序列如下：
[0011] 引物IF:5'-AACCAATGGAGTTTTTAACAT-3'（SEQIDN0:1)
[0012] 引物 1R:5'-TAAGAGGAACACCACACTCAC-3'（SEQIDN0:2)
[0013] 引物 2F:5'-CTGGAGCAATGCGGGTTC-3'（SEQIDN0:3)
[0014]引物2R :5'-GGAACCTTGACCCTCTTG-3'（SEQ ID N0:4)
[0015]引物3F:5'-AAATACTCAGCGAAGGTCTTGC-3'（SEQ IDN0:5)
[0016] 引物 3R:5,-CGAGCCTTCCTCTGTTGC-3,（SEQIDN0:6)
[0017] 引物 4F:5'-TCCCAACCAAGGAAATA-3'（SEQIDN0:7)
[0018] 引物 4R:5'-GCAATACTGGACAACCC-3'（SEQIDN0:8)
[0019] 需要說明的是：引物的優(yōu)劣會(huì)直接影響到PCR擴(kuò)增的特異性與成功與否，本發(fā)明 所設(shè)計(jì)的引物序列保守，長度適宜，可避免產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增，同時(shí)根據(jù)擴(kuò)增的位點(diǎn)在基因 上距離的遠(yuǎn)近進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，避免引物過多造成干擾，影響擴(kuò)增效率；這遠(yuǎn)非是常規(guī)的引物 設(shè)計(jì)所能得到的。
[0020] 所述探針序列如下：
[0021] IVS7-2P:5'-TATTTCGGACGATAATTGCTAC-3'（SEQIDN0:9)
[0022] 2168P:5'-CACATTCTTTTTGACGGTCCGTG-3'（SEQIDN0:10)
[0023] 1174P:5'-CCTTTGGGATCAGCTACATCTTC-3'（SEQIDN0:11)
[0024] 1229P:5'-CTGCTCTTTCCCGCATGGCCGTC-3'（SEQ IDN0:12)
[0025] 1226P:5'-CACCACTGCTCTTTCCCACACGG-3'（SEQIDN0:13)
[0026]1975P:5'-CCAATCCATAGCCTTCTGCTTGAC-3'（SEQIDN0:14)
[0027] 2027P:5,-TTGTTGGAGTGAGATCACAGCG-3'（SEQ IDNO:15)
[0028] 所述探針還分別連接有熒光發(fā)光基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)，其中，用于檢測(cè)IVS7-2、 2168U174位點(diǎn)的探針的熒光發(fā)光基團(tuán)分別為VIC、ROX、Cy5;用于檢測(cè)1229、1226、1975、 2027位點(diǎn)的探針的熒光發(fā)光基團(tuán)均為TAMRA;各探針的熒光淬滅基團(tuán)均為BHQ-1。
[0029] 該遲發(fā)性耳聾基因多通道熒光PCR檢測(cè)試劑盒，還包括用于監(jiān)測(cè)擴(kuò)增模板的有效 性的1對(duì)0-Actin內(nèi)參引物和1條內(nèi)參探針，其序列分別如序列表中SEQIDNO:16、SEQ IDNO: 17 和SEQIDNO: 18 所示。
[0030] 具體的，0-Actin內(nèi)參引物的序列如下：
[0031] 0-ActinF:5'-CACCCAGCACAATGAAGA-3'(SEQIDNO:16)
[0032] 0-ActinR:5'-AAGGTGGACAGCGAGGC-3'(SEQIDNO:17)
[0033] 內(nèi)參探針的序列為：
[0034] 0-ActinP:5，-CTCCTGAGCGCAAGTACTCCGTG-3,（SEQ ID N0:18)
[0035] 所述內(nèi)參探針的熒光發(fā)光基團(tuán)為FAM，熒光淬滅基團(tuán)為BHQ-1。
[0036] 該遲發(fā)性耳聾基因多通道熒光PCR檢測(cè)試劑盒，還包括有陰性質(zhì)控、陽性質(zhì)控，陰 性質(zhì)控為連入T載體的內(nèi)參基因、正常ros基因部分序列，其序列如序列表中SEQIDNO: 19 所示；陽性質(zhì)控為連入T載體的內(nèi)參基因、含IVS7-2、2168、1174、1229突變位點(diǎn)部分序列， 其序列如序列表中SEQIDN0:20所示。質(zhì)控的設(shè)立可保證檢測(cè)結(jié)果在控，避免假陰性、假 陽性的出現(xiàn)。
[0037] 具體的，一種遲發(fā)性耳聾基因多通道熒光PCR檢測(cè)試劑盒，由DNA提取液、PCR 反應(yīng)液、陰性質(zhì)控和陽性質(zhì)控組成，其中，每50y1PCR反應(yīng)液的組成為：10XPCR緩沖液 5. 0y1、MgCl22. 0 ~5.OmM、dNTPs0? 5 ~1. 5mM、引物 0? 2 ~2. 0yM、探針 0? 1 ~1. 0yM、 Taq酶2. 0~4. 0U、UNG酶0. 5~1. 0U，加水至50y1。所述引物為引物1、引物2、引物3、 引物4和內(nèi)參引物；所述探針為7條檢測(cè)是否含有突變的探針和1條內(nèi)參探針。UNG酶的 加入有效去除PCR擴(kuò)增前的U-DNA污染。
[0038] 采用該遲發(fā)性耳聾基因多通道熒光PCR檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)的方法，步驟