向基因區(qū)段的末 端加入兩個相對的啟動子（例如T7啟動子；SEQ ID NO: 48和49)來合成雙鏈RNA，其中將 SEQ ID NO: 48置于緊靠基因的5'而將SEQ ID NO: 49置于緊靠基因區(qū)段的3'。然后可 用T7 RNA聚合酶體外轉(zhuǎn)錄所述dsRNA。
[0095] 用于合成根據(jù)本發(fā)明實施方案的dsRNA的序列的實例在SEQ ID NO: 50-91和 93-106中提供。
[0096] 用于合成根據(jù)本發(fā)明實施方案的dsRNA的引物的實例在SEQ ID NO: 107-134中 提供（每對代表正向和反向引物，參見實施例部分的表1)。
[0097] 在一些實施方案中，本文提供的核酸劑可與細胞滲透肽功能上相關。本文所用的 "細胞滲透肽"為包含以下短（約12-30個殘基）氨基酸序列或功能性基序的肽，所述短氨 基酸序列或功能性基序賦予與轉(zhuǎn)運透膜復合體穿過細胞的質(zhì)膜和/或核膜相關的能量獨 立性（即，非內(nèi)吞性）易位特性。用于本發(fā)明的透膜復合體的細胞滲透肽優(yōu)選包含至少一 個非功能性半胱氨酸殘基，其為游離的或被衍生以與雙鏈核糖核酸形成二硫鍵，所述雙鏈 核糖核酸已針對這類鍵進行修飾。賦予這類特性的代表性氨基酸基序列舉于美國專利號 6, 348, 185中，其內(nèi)容通過引用明確地結(jié)合于本文中。優(yōu)選本發(fā)明的細胞滲透肽包括但不限 于：penetratin、transportan、plsl、TAT (48-60)、pVEC、MTS 和 MAP。
[0098] 如本文所詳述的，蜂飼喂在養(yǎng)蜂人中是通常作法，以提供營養(yǎng)和其它需要（例如， 補充的需要）。蜂通常以蜂蜜和花粉為食，但是已知其也攝取非天然飼料?？晌菇o蜂多種食 料，包括但不限于Wheast (在酪農(nóng)農(nóng)干酪上生長的乳品酵母）、大豆粉、酵母（例如釀酒酵 母（brewer's yeast)、圓酵母（torula yeast))和單獨或組合地飼喂的酵母產(chǎn)物以及作為 蜂巢內(nèi)的干混合物或濕餅或者作為蜂巢外敞開的飼養(yǎng)器中的干混合物飼喂的大豆粉。也可 使用糖或糖漿。向飼喂給蜂的補充物中添加10-12%的花粉改善適口性。添加25-30%的花 粉改善蜂用于生命活動所需的必需營養(yǎng)物的質(zhì)和量。
[0099] 蔗糖或甜菜糖、異構(gòu)化玉米糖漿和50型糖漿為蜜蜂的天然飲食中蜂蜜的良好代 用品。后兩者可僅作為液體供應給蜂。
[0100] 可通過例如下列方法中的任一種將液體飼料供應在蜂巢內(nèi)的給蜂：靠摩擦擰緊蓋 子的桶（friction-top pail)、育卵室內(nèi)的蜂房、柜式飼養(yǎng)器、boardman飼養(yǎng)器等。可通過 在倒置的內(nèi)罩上放置一或兩鎊來飼喂干糖。供水必須為蜂一直都可獲取的。在一個實施方 案中，設想了其中存在漂浮的支持物（例如木片、軟木塞或塑料海綿）的盤或托盤。蜂的補 充飼料的詳述可在例如由Standifer等1977,標題為"蜜蜂群體的補充喂食（Supplemental Feeding of Honey Bee Colonies)" 的 USDA 出版物（USDA，Agriculture Information Bulletin No. 413)中找到。
[0101] 要理解的是，瓦螨在蜂的外骨骼中產(chǎn)生傷口部位。這類傷口部位隱匿有細菌感染， 例如蜂房球菌，其導致歐洲幼蟲腐臭病。此外，因為它們的寄生作用，懷疑瓦螨充當許多蜜 蜂病原體（包括羽翼畸形病毒（DWV)、克什米爾蜜蜂病毒（KBV)、蜜蜂急性麻痹病毒（ABPV) 和黑蜂王臺病毒（BQCV))的載體，并且瓦螨可減弱其宿主的免疫系統(tǒng)，使得它們易受感染 的攻擊。
[0102] 因此，通過殺死螨（或防止其繁殖），本發(fā)明的物質(zhì)可用來預防和/或治療細菌感 染（例如蜂房球菌感染）以及由以上命名的病毒引起的病毒感染。
[0103] 由于認為瓦螨侵染和病毒感染為蜂群崩潰失調(diào)?。–CD)的原因，因此本發(fā)明物質(zhì) 也可用來防止或減少蜂群體對CCD的易感性。
[0104] 要理解的是，除了飼喂寡核苷酸和/或多核苷酸用來減少蜂病原體感染和侵染之 外，實行適當?shù)沫h(huán)境衛(wèi)生（例如，制止受侵染蜂巢的再使用）可增加治療和預防感染的有效 性。
[0105] 本文所用的術語"約"是指± 10 %。
[0106] 術語"包括"、"包括的"、"包含"、"包含的"、"具有"及其變化意為"包括但不限于"。 此術語包含術語"由……組成"和"基本由……組成"。
[0107] 短語"基本由……組成"意指僅當附加的成分和/或步驟未實質(zhì)上改變所要求保 護的組合物或方法的基本特征和新特征時，所述組合物或方法可包含附加的成分和/或步 驟。
[0108] 除非文段另有明確指示，否則本文所用的單數(shù)形式"一"、"一個"和"所述"也包括 復數(shù)所指。例如，術語"化合物"或"至少一種化合物"可包含多種化合物，包括其混合物。
[0109] 本文所用的術語"方法"是指完成給定任務的方式、手段、技術和程序，包括但不 限于化學、藥理學、生物學、生物化學和醫(yī)學領域的從業(yè)者已知的或從所述從業(yè)者已知的方 式、手段、技術和程序容易地開發(fā)的那些方式、手段、技術和程序。
[0110] 本文所用的術語"治療"包括消除、基本上抑制、減緩或逆轉(zhuǎn)病況的行進，基本上改 善病況的臨床或美學癥狀或者基本上防止出現(xiàn)病況的臨床或美學癥狀。
[0111] 要理解的是，在單獨的實施方案的文段中因清楚目的而描述的本發(fā)明的某些特 征，也可在單個實施方案中以組合提供。反之，在單個實施方案的文段中因簡明目的而描述 的本發(fā)明的多個特征，也可單獨地或以任何適宜的子組合提供，或者適宜的話提供在本發(fā) 明的任何其它描述的實施方案中。除非實施方案在不具備那些要素時無法實施，否則不應 認為在多個實施方案的文段中描述的某些特征為那些實施方案的必不可少的特征。
[0112] 如上文中所描述和如所附權(quán)利要求部分所要求保護的本發(fā)明的多個實施方案和 方面在下列實施例中找到實驗支持。 實施例
[0113] 現(xiàn)對以下實施例進行引用，其連同下列描述以非限制性方式闡述本發(fā)明的一些實 施方案。
[0114] 一般而言，本文所用的術語和本發(fā)明中所使用的實驗室程序包括分子技術、生物 化學技術、微生物學技術和重組DNA技術。在文獻中充分解釋了這類技術。參見，例如"分子 克隆：實驗室手冊（Molecular Cloning: A laboratory Manual) "Sambrook等，（1989)分 子生物學中的現(xiàn)行方案（Current Protocols in Molecular Biology) "I_III 卷 Ausubel， R. M·，編輯（1994) ;Ausubel等，"分子生物學中的現(xiàn)行方案（Current Protocols in Molecular Biology)"，John Wiley 和 Sons，Baltimore，Maryland (1989) ;Perbal，"分子 克隆的實踐指南（A Practical Guide to Molecular Cloning) "，John Wiley & Sons，New York (1988) ;Watson等，"重組DNA(Recombinant DNA)'Scientific American Books，New York ;Birren等（編輯）"基因組分析：實驗室手冊系列（Genome Analysis: A Laboratory Manual Series) " 1-4 卷，Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998);如 在美國專利號 4, 666, 828 ;4, 683, 202 ;4, 801，531 ;5, 192, 659 和 5, 272, 057 中所述的方法； "細胞生物學：實驗室手冊（Cell Biology: A Laboratory Handbook)"，I-III 卷 Cellis， J. E.，編輯（1994)動物細胞培養(yǎng)--基礎技術手冊（Culture of Animal Cells - A Manual of Basic Technique)"，F(xiàn)reshney，Wiley-Liss，N. Y. (1994)，第三版；"免疫 學中的現(xiàn)行方案（Current Protocols in Immunology) " I-III 卷 Coligan J. Ε·，編輯 (1994) ;Stites 等（編輯），"基礎和臨床免疫學（Basic and Clinical Immunology)"（第 8版），Appleton & Lange，Norwalk，CT (1994) ;Mishell 和 Shiigi (編輯），"細胞免疫學 中所選擇的方法（Selected Methods in Cellular Immunology) "，W. Η· Freeman 和 Co.， New York (1980);在專利和科學文獻中廣泛描述的可用的免疫測定法，參見例如美國專 利號 3, 791，932 ;3, 839, I53 ;3, 85〇, 752 ;3, 85〇, 578 ;3, 853, 987 ;3,部7, 5I7 ;3, 879, 262 ; 3, 901, 654 ；3, 935, 074 ；3, 984, 533 ；3, 996, 345 ；4, 034, 074 ；4, 098, 876 ；4, 879, 219 ； 5, 011, 771 和 5, 281, 521 寡核苷酸合成（Oligonucleotide Synthesis) "Gait，M. J.，編 輯（1984)核酸雜交（Nucleic Acid Hybridization)'Tiames，B· D·，和Higgins S. J·，編 輯（1985)轉(zhuǎn)錄和翻譯（Transcription and Translation)'Tiames，B· D·，和 Higgins S. J.，編輯（1984)動物細胞培養(yǎng)（Animal Cell Culture) "Freshney，R. I.，編輯（1986); "固定化細胞和酶（Immobilized Cells and Enzymes) " IRL Press，（1986)分子克隆的 實踐指南（A Practical Guide to Molecular Cloning) "Perbal，B·，（1984)和"酶學中 的方法（Methods in Enzymology)" 1-317 卷，Academic Press ;"PCR 方案：方法和應用 的指南（PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications)"，Academic Press， San Diego, CA (1990) ;Marshak等，"用于蛋白質(zhì)純化和表征的策略--實驗室課程手冊 (Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual) "CSHL Press (1996);其全部通過如同完全地在本文中描述的引用而結(jié)合。在此 文件的各處提供了其它的一般引用。認為其中的程序為本領域眾所周知的，為了讀者的方 便而提供所述程序。其中所包含的全部信息通過引用結(jié)合于本文中。
[0115] 實施例1 飼喂瓦螨特異性dsRNA預防瓦螨侵染 為了確定攝取的dsRNA對瓦螨侵染的有效性，如圖1所示，與瓦螨接觸前7天和與瓦螨 接觸后2天，在飼料中給蜜蜂供應瓦螨特異性dsRNA和對照dsRNA。計算每個實驗蜂巢死亡 瓦螨的數(shù)量，并收集活瓦螨和死瓦螨樣品用于分子分析。
[0116] 材料和方法 A壟游碧立.·從當?shù)仞B(yǎng)蜂場的蜂巢中收集幼年（約2月齡）蜂王連同約200 只工蜂。將蜂轉(zhuǎn)移到用一個小型蜂房裝配的小型蜂巢中，所述小型蜂房預先由規(guī)則的蜂巢 建立。封蓋全部小型蜂巢并置于控溫房中（30°C)。
[0117] ?/Ρ姻廣《備.·將瓦螨序列克隆到質(zhì)粒的兩個相對的T7啟動子之間。