一種鉤狀結(jié)構(gòu)寡肽及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于工業(yè)生物催化和酶工程領(lǐng)域，具體設(shè)及一種鉤狀結(jié)構(gòu)寡膚及其在目標(biāo) 酶的活性、穩(wěn)定性改造中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 鹽橋，即兩種帶相反電荷的氨基酸之間的庫侖相互作用。結(jié)構(gòu)研究表明，嗜熱 蛋白比嗜溫同源蛋白含有更多的極性氨基酸殘基和形成更多的鹽橋，例如超嗜熱古菌 P.化riosus的P化-GHD酶分子中，每10個(gè)殘基就有1. 1個(gè)鹽橋，而中溫菌Clostridium symbisun的Csy-GHD酶分子中，每10個(gè)殘基只有0. 6個(gè)鹽橋。無論是古細(xì)菌還是細(xì)菌類 蛋白質(zhì)，總鹽橋含量和鹽橋網(wǎng)絡(luò)的比例都隨著耐熱性的增加而增加。另一方面，在整個(gè)蛋 白質(zhì)構(gòu)象中，膚鏈的自由末端的構(gòu)象通常最不穩(wěn)定。W兩種嗜熱膳水合酶為例，酶的熱失 活導(dǎo)致的構(gòu)象伸展解離首先發(fā)生在膚鏈末端殘基，而且其不穩(wěn)定程度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其它區(qū)域的 氨基酸殘基（LiuJ.等，JournalofMole州larGraphicsandModelling, 2008,27(4); 529 - 535)。對嗜溫膳水合酶的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行定點(diǎn)突變，在其亞基內(nèi)部和亞基末端分別插 入來自嗜熱膳水合酶的鹽橋結(jié)構(gòu)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對膳水合酶鹽橋末端進(jìn)行改造的突變酶具有 顯著提高的穩(wěn)定性（QienJ.等，JournalofBiotechnology2012,164:354 - 362)。
[0003] 常規(guī)的基因工程和蛋白質(zhì)工程研究中，對酶活性和穩(wěn)定性進(jìn)行改造的方法一般是 進(jìn)行異源基因重組表達(dá)和基因定點(diǎn)/隨機(jī)突變。該些方法都依賴于具體的基因和蛋白質(zhì)序 列。例如，日本S菱麗陽株式會(huì)社公開了專利《改良型膳水合酶》（公開號(hào)；CN 1961072A)， 對膳水合酶0亞基第93位、第167位和219位氨基酸殘基進(jìn)行定點(diǎn)突變，提高了膳水合 酶的熱穩(wěn)定性。清華大學(xué)構(gòu)建了a亞基起始密碼子突變的膳水合酶，并在大腸桿菌中實(shí) 現(xiàn)了高活性表達(dá)（專利號(hào)；ZL200410042576.0，"一種膳水合酶及其編碼基因與應(yīng)用"）；清 華大學(xué)還在中國發(fā)明專利"一種膳水合酶基因簇及其應(yīng)用"中公開了赤（紅色）紅球菌 化odococcus ruber TH中與膳水合酶高表達(dá)相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因和調(diào)控基因序列（專利號(hào)；ZL 200910076710. 1);在中國發(fā)明專利"一種突變膳水合酶"中，公開了一種定點(diǎn)突變酶的亞 基末端改造膳水合酶耐熱性、產(chǎn)物耐受性和超聲穩(wěn)定性的方法（專利號(hào)；ZL201110415465. 幻。日本=菱化成株式會(huì)社對來自根瘤菌屬的膳水合酶基因和蛋白申請了專利《具有膳水 合酶活性的新型蛋白和編碼該蛋白的基因》（申請?zhí)枺?3106122.9) 井化學(xué)株式會(huì)社對 來自嗜熱假諾卡氏菌JCM3095的膳水合酶的蛋白化及編碼它的基因申請了專利《參與活化 膳水合酶的蛋白化及編碼它的基因》（專利號(hào)；CN1250568C);《新型膳水合酶》研究了該基 因在重組大腸桿菌中的表達(dá)（專利號(hào)；CN1243825C);德國底古薩股份公司申請了《紅球菌 屬的膳水合酶》（專利號(hào)；CN1930299B)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的之一在于提供一種鉤狀結(jié)構(gòu)寡膚（或者稱之為寡膚標(biāo)簽）。
[0005] 所述的鉤狀結(jié)構(gòu)寡膚，由3-12個(gè)氨基酸殘基組成，其中至少含有一個(gè)正電氨基酸 殘基和一個(gè)負(fù)電氨基酸殘基，且所述正電氨基酸和負(fù)電氨基酸之間至少間隔1個(gè)氨基酸殘 基并且正電氨基酸和負(fù)電氨基酸之間形成正負(fù)電離子對。
[0006] 優(yōu)選的，上述的鉤狀結(jié)構(gòu)寡膚，由5-12個(gè)氨基酸殘基組成，其中至少含有一個(gè)正 電氨基酸殘基和一個(gè)負(fù)電氨基酸殘基，且所述正電氨基酸和負(fù)電氨基酸之間至少間隔1個(gè) 氨基酸殘基并且正電氨基酸和負(fù)電氨基酸之間形成正負(fù)電離子對。
[0007] 優(yōu)選的，上述的鉤狀結(jié)構(gòu)寡膚，其具有5個(gè)氨基酸殘基GXPYG，其中G為甘氨酸，P 為脯氨酸，X和Y分別為帶相反電荷的正電氨基酸和負(fù)電氨基酸。
[000引所述正電氨基酸為精氨酸Arg(R)或賴氨酸Lys(K);所述帶負(fù)電氨基酸為天冬氨 酸Asp值）或谷氨酸Glu似。
[0009] 上述鉤狀結(jié)構(gòu)寡膚，所述氨基酸殘基GXPYG為GRPEG、GRPDG、GKPEG或GKPDG。
[0010] 具有上述GX…P'''YG的氨基酸序列，其氨基酸殘基為5-12個(gè)，例如氨基酸殘基為 6個(gè)或7個(gè)或9個(gè)或11個(gè)，經(jīng)氨基酸增減，也能夠形成"鉤子"結(jié)構(gòu)的寡膚結(jié)構(gòu)序列。
[0011] 通過設(shè)計(jì)、構(gòu)建具有獨(dú)特的自回轉(zhuǎn)"鉤子"結(jié)構(gòu)的寡膚結(jié)構(gòu)序列，可W不依賴于目 標(biāo)酶的基因序列和蛋白質(zhì)序列，將鉤狀寡膚模塊像標(biāo)簽一樣"貼"在不同蛋白酶的N-末端、 C-末端或N/C-末端，通過剛性鹽橋結(jié)構(gòu)的馴定來減少膚鏈末端的結(jié)構(gòu)自由度及其在受熱 /有機(jī)溶劑等惡劣環(huán)境下的伸展失活，從而快速、高效、普適性地提升各種酶的穩(wěn)定性或活 性。
[0012] 本發(fā)明的目的之一還在于提供一種提高酶抗逆性的方法和一種提高酶活性的方 法。
[0013] 所述的提高酶抗逆性的方法，將上述任一所述的鉤狀寡膚序列插入目標(biāo)酶的亞基 末端。
[0014] 所述的提高酶活性的方法，將上述任一所述的鉤狀寡膚序列插入目標(biāo)酶的亞基末 玉山 乂而。
[0015] 所述目標(biāo)酶為膳水合酶或其突變體或膳水解酶或其突變體。
[0016] 可通過在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)引物中引入鉤狀結(jié)構(gòu)寡膚序列，經(jīng)過一步PCR擴(kuò) 增即可在目標(biāo)酶的N-末端或C-末端插入鉤狀寡膚標(biāo)簽基因，獲得穩(wěn)定的酶。
[0017] 本發(fā)明的目的之一還在于提供一種酶。
[001引一種酶，將上述任一所述的鉤狀寡膚序列插入目標(biāo)酶的亞基末端形成，所述目標(biāo) 酶為膳水合酶或其突變體或膳水解酶或其突變體。
[0019] 特別的，本發(fā)明的目的之一還在于提供一種膳水合酶。
[0020] 一種膳水合酶，將上述一所述的鉤狀寡膚序列插入目標(biāo)酶的亞基末端形成，所述 目標(biāo)酶為膳水合酶或其突變體；所述亞基末端為W下一種W上；a亞基的N末端、a亞基 的C末端、0亞基的N末端或0亞基的C末端。鉤狀結(jié)構(gòu)寡膚序列插入總數(shù)量為1-3個(gè)。
[0021] 本發(fā)明的目的也在于提供編碼上述膳水合酶的基因、含有所述基因的表達(dá)載體、 含有所述基因的轉(zhuǎn)化體。
[0022] 所述轉(zhuǎn)化體為大腸桿菌或紅球菌。
[0023] 上述轉(zhuǎn)化體的構(gòu)建方法，可采用氯化巧法或電穿孔轉(zhuǎn)化法（SambrookJ 等.MolecularCloning:ALaboratorymanual.ColdSpringHarbor,NY:CoIdSpring HarborL油oratoryPress. 1989)將載體導(dǎo)入受體菌。也可W將改良膳水合酶基因直接插 入轉(zhuǎn)化體的