胚乳淀粉合成相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于植物學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域；更具體地，本發(fā)明涉及胚乳淀粉合成相關(guān)的 轉(zhuǎn)錄因子及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 水稻的ryza sativa L)是我國(guó)主要的糧食作物之一。稻米中淀粉含量62~86〇/〇， 是人們食用的主要成分。水稻中的淀粉主要W淀粉粒的形式儲(chǔ)藏于種子的胚乳中。胚乳中 淀粉的含量和結(jié)構(gòu)直接影響著水稻的產(chǎn)量和稻米的質(zhì)量，如聖白是由于胚乳淀粉和蛋白質(zhì) 顆粒排列不夠緊密而產(chǎn)生的不透明部分，又如稻米的直鏈淀粉含量的高低與米飯的黏性、 柔軟性、光澤和食味品質(zhì)密切相關(guān)。水稻胚乳中的淀粉合成涉及到細(xì)胞質(zhì)、造粉體兩個(gè)細(xì) 胞器，ADPG焦磯酸化酶、顆粒性結(jié)合型淀粉合成酶、可溶性淀粉合成酶、淀粉分支酶、去分支 酶、淀粉磯酸化酶六類酶，a-1,4-糖巧鍵和a-1,6-糖巧兩類化學(xué)鍵的形成。淀粉合成過(guò) 程是一系列酶在時(shí)間和空間協(xié)同作用的鹿大而復(fù)雜的過(guò)程。
[0003] 多項(xiàng)研究表明，水稻中的淀粉合成酶類基因從表達(dá)的組織部位和時(shí)期來(lái)區(qū)分，可 W分為相對(duì)獨(dú)立的兩類，葉片高表達(dá)和胚乳中高表達(dá)。其中14個(gè)淀粉合成酶類基因在水稻 開(kāi)花后7天胚乳高表達(dá)，與胚乳中的淀粉合成密切相關(guān)。該14個(gè)基因具有相似的表達(dá)特 征，推測(cè)水稻胚乳中存在一個(gè)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，特異調(diào)控該些基因的表達(dá)，使其協(xié)同參與胚乳中的 淀粉合成。
[0004] 本發(fā)明人W前的研究發(fā)現(xiàn)，水稻未成熟種子核蛋白可W結(jié)合淀粉分支酶基因SBE1 的啟動(dòng)子片段巧3,而且該種結(jié)合可W被顆粒性結(jié)合型淀粉合成酶基因Wx的啟動(dòng)子片段化 所競(jìng)爭(zhēng)。該兩個(gè)啟動(dòng)子片段中含有數(shù)個(gè)ACGT核也元件，通過(guò)突變實(shí)驗(yàn)證明了 ACGT元件是 水稻未成熟種子核蛋白的結(jié)合位點(diǎn)，而體外表達(dá)的水稻bZIP類轉(zhuǎn)錄因子R邸也可W結(jié)合于 該兩個(gè)啟動(dòng)子片段。
[0005] 本發(fā)明人進(jìn)一步找到了 一些化bZIP類轉(zhuǎn)錄因子，可W特異結(jié)合SBE1的 啟動(dòng)子片段C53(L0C_0s06g51084, -116~-42)，W及Wx的啟動(dòng)子片段化(L0C 0s06g04200, -1651~-1399)。并對(duì)0sbZIP58/RISBZl的功能進(jìn)行了深入分析，發(fā)現(xiàn) 化bZIP58通過(guò)結(jié)合于水稻胚乳高表達(dá)的淀粉合成酶類基因啟動(dòng)子中富含ACGT元件的片 段，調(diào)控若干淀粉合成酶類基因的表達(dá)，最終影響了水稻胚乳的淀粉合成。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供胚乳淀粉合成相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子及其應(yīng)用。
[0007] 在本發(fā)明的第一方面，提供一種改良禾本科植物的方法，包括：提高禾本科植物中 化bZIP34蛋白或其同源蛋白的表達(dá)。
[0008] 在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的改良禾本科植物是改良禾本科植物的產(chǎn)量性狀；較佳地， 包括：提高禾本科植物的產(chǎn)量；或增加禾本科植物種子的千粒重。
[0009] 在另一優(yōu)選例中，所述的改良禾本科植物是改良禾本科植物種子的性狀；較佳地， 包括：
[0010] 增加禾本科植物種子的總淀粉含量；
[0011] 增加禾本科植物種子直鏈淀粉含量；或
[0012] 降低禾本科植物種子中的可溶性糖含量。
[0013] 在另一優(yōu)選例中，所述的化bZIP34蛋白或其同源蛋白通過(guò)結(jié)合SBE1基因啟動(dòng)子 和/或Wx基因啟動(dòng)子發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，改良禾本科植物。
[0014] 在另一優(yōu)選例中，所述的提高禾本科植物中化bZIP34蛋白或其同源蛋白的表達(dá) 包括：
[0015] (1)將外源的化bZIP34蛋白或其同源蛋白的編碼基因轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞、組織、器官 或組織，獲得轉(zhuǎn)化入化bZIP34蛋白或其同源蛋白的編碼基因的植物細(xì)胞、組織、器官或種 子；和
[001引 0)將步驟（1)獲得的轉(zhuǎn)入了外源化bZIP34蛋白或其同源蛋白的編碼基因的植物 細(xì)胞、組織、器官或種子再生成植物植株。
[0017] 在另一優(yōu)選例中，所述的方法包括步驟：
[0018] (si)提供攜帶表達(dá)載體的農(nóng)桿菌，所述的表達(dá)載體含有化bZIP34蛋白或其同源 蛋白的編碼基因；
[0019] (s2)將植物細(xì)胞、組織、器官與步驟（si)中的農(nóng)桿菌接觸，從而使化bZIP34蛋白 或其同源蛋白的編碼基因轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞，并且整合到植物細(xì)胞的染色體上；
[0020] (S3)選擇出轉(zhuǎn)入化bZIP34蛋白或其同源蛋白的編碼基因的植物細(xì)胞、組織、器官 或種子；W及
[0021] (s4)將步驟（S3)中的植物細(xì)胞、組織、器官或種子再生成植物。
[0022] 在另一優(yōu)選例中，所述的化bZIP34蛋白是：
[0023] (a)具有SEQ IDNO:2所示氨基酸序列的蛋白；
[0024] 化）將SEQ ID NO:2所示氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或多個(gè)（如1-30個(gè)；較佳地1-20 個(gè)；更佳地1-10個(gè)；更佳地1-5個(gè)）氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有（a) 限定的蛋白功能的蛋白；
[002引 （C)與SEQ ID N0:2所示氨基酸序列的蛋白的序列相同性高于70%(較佳地高于 80% ;更佳地高于90% ;更佳地高于95% ;更佳地高于98% ;更佳地高于99%)，且具有（a)限定 的蛋白功能的蛋白；或
[0026] (d)具有（a)限定的蛋白功能的SEQ ID N0:2所示氨基酸序列的蛋白的活性片段。
[0027] 在另一優(yōu)選例中，所述的禾本科植物是水稻。
[0028] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種化bZIP34蛋白或其同源蛋白的用途，用于改良禾 本科植物。
[0029] 在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的改良禾本科植物是改良禾本科植物的產(chǎn)量性狀；較佳地， 包括：
[0030] 提高禾本科植物的產(chǎn)量；或
[0031] 增加禾本科植物種子的千粒重。
[0032] 在另一優(yōu)選例中，所述的改良禾本科植物是改良禾本科植物種子的性狀；較佳地， 包括：
[0033] 增加禾本科植物種子的總淀粉含量；
[0034] 增加禾本科植物種子直鏈淀粉含量；或
[0035] 降低禾本科植物種子中的可溶性糖含量。
[0036] 在另一優(yōu)選例中，所述的禾本科植物是水稻。
[0037] 本發(fā)明的其它方面由于本文的公開(kāi)內(nèi)容，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn) 的。
【附圖說(shuō)明】
[0038] 圖1、化bZIP34基因結(jié)構(gòu)示意圖。
[0039] A.化bZIP34兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本基因結(jié)構(gòu)示意圖。
[0040] B.化bZIP34蛋白保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)。
[0041] C.化bZIP34與玉米的ZmEmbp-la、擬南芥的AtGBFl蛋白質(zhì)序列的多重比較。
[0042] 圖2、化bZIP34的蛋白生化功能。
[0043] A. 0sbZIP：M定位于細(xì)胞核。
[0044] B.酵母載體示意圖。
[0045] C.化bZIP34結(jié)合Wx基因和SBE1基因啟動(dòng)子片段。
[0046] 圖3、化bZIP34的時(shí)空表達(dá)模式。
[0047] A.半定量RT-PCR檢測(cè)化bZIP34在各組織部位的表達(dá)模式。葉片1 ;4周小苗完全 展開(kāi)第一葉葉片；葉銷(xiāo)1 :4周小苗完全展開(kāi)第一葉葉銷(xiāo)；葉片2 ;抽穗前倒一葉葉片；葉銷(xiāo) 2;抽穗前倒一葉葉銷(xiāo)；根：抽穗期水稻根；莖；抽穗期水稻莖。幼穗：長(zhǎng)3cm左右幼穗。種 子：開(kāi)花后第7天未成熟種子。
[0048] B. qRT-PCR檢測(cè)化bZIP34在水稻種子發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)模式。DAF值ay after flower)。
[0049] 圖4、0sbZIP34: :GUS轉(zhuǎn)基因植株中GUS活性的檢測(cè)。標(biāo)尺=lcm(A-B)或Imm(C-G)。
[0050] A.節(jié)與節(jié)間。B.幼穗。C.葉枕。D. 1DAF未成熟種子。E.開(kāi)花前小花。F. 5DAF 未成熟種子。G. 10DAF未成熟種子。
[0051] 圖5、化bZIP34過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株分析。
[0052] A. W〇sActin-ll(AK100267)基因?yàn)閮?nèi)參基因，通過(guò)半定量 RT-PCR 檢測(cè) 0sbZIP34 過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株種子中化bZIP34的表達(dá)情況，1為野生型的中花11，2~10為T(mén)3代純合 的化bZIP34過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株。
[0053] B.化bZIP34過(guò)表達(dá)和化bZIP34RNAi轉(zhuǎn)基因植株種子，標(biāo)尺為1cm。
[0054] 圖6、化bZIP34RNAi轉(zhuǎn)基因植株未成熟種子下游基因檢測(cè)。
[00巧]A.化bZIP34RNAi轉(zhuǎn)基因植株未成熟種子中淀粉合成基因表達(dá)下調(diào)。
[0056] B.糖轉(zhuǎn)運(yùn)基因表達(dá)下調(diào)。
【具體實(shí)施方式】
[0057] 本發(fā)明人經(jīng)過(guò)深入的研究，首次掲示一種轉(zhuǎn)錄因子化bZIP34可應(yīng)用于改良禾本 科植物的產(chǎn)量性狀或禾本科植物種子的淀粉性狀。
[0058] 如本文所用，所述的"植物"為適合進(jìn)行基因的轉(zhuǎn)化操作的植物。較佳的，所述的 植物是禾本科植物，如水稻、小麥、大麥、黑麥、玉米、高梁。
[0059] 淀粉分支酶I(starch-branching enzymeI;S邸 1)和蠟質(zhì)基因（waxy ;Wx);是 本領(lǐng)域公知的參與水稻胚乳中淀粉合成的基因。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，0sbZIP34可W結(jié)合SBE1基 因啟動(dòng)子C53片段