特異性鑒別羊乳中摻加牛乳的單克隆抗體及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種特異性鑒別羊乳中滲加牛乳的單克隆抗 體及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 羊乳脂肪球和蛋白顆粒較小，僅為牛奶的1/3,尤其是羊乳成分和人類(lèi)母乳相對(duì)接 近，人體吸收率達(dá)95%。在歐美及國(guó)內(nèi)港澳臺(tái)市場(chǎng)，羊奶價(jià)格遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于牛乳，國(guó)內(nèi)越來(lái)越多的 消費(fèi)者也趨向于選擇羊乳。但羊乳產(chǎn)量有限，市場(chǎng)上供不應(yīng)求，有人在羊乳中滲加牛乳，嚴(yán) 重影響羊乳產(chǎn)品的聲譽(yù)，損害消費(fèi)者的利益。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的是提供一種特異性鑒別羊乳中滲加牛乳的單克隆抗體及其制備方 法，所得單克隆抗體僅識(shí)別牛乳非乳清抗原，而不與羊乳發(fā)生交叉反應(yīng)。
[0004] 本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是； 特異性鑒別羊乳中滲加牛乳的單克隆抗體的制備方法，其特征在于： 包括W下步驟： 步驟一；制備免疫抗原： 取新鮮牛乳置于4°C離屯、機(jī)，4000~600化pm，10~20min離屯、；牛乳分層，上層主要為脂 肪，完全棄去，保留并充分混勻剩余部分，即為脫脂乳，作為免疫抗原； 步驟二；免疫： 取6-8周齡雌性BALB/c小鼠，利用免疫抗原免疫4次，免疫結(jié)束S天后進(jìn)行細(xì)胞融合； 步驟制備雜交瘤細(xì)胞： 細(xì)胞融合前一天，制備飼養(yǎng)層細(xì)胞； 細(xì)胞融合于無(wú)菌條件下進(jìn)行，將分離的脾細(xì)胞與SP2/0瘤細(xì)胞按（5-10) ;1的比例混 合，在PEG1500的作用下進(jìn)行細(xì)胞融合，將融合后的雜交瘤細(xì)胞鋪于含有飼養(yǎng)層細(xì)胞的96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，置于37°C，5% C〇2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)； 步驟四：篩選雜交瘤細(xì)胞： 按照常規(guī)間接ELISA檢測(cè)雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清；分別用鮮牛乳、鮮羊乳、牛乳清作為包 被抗原，200ul/孔，包被后，4°C過(guò)夜，PBST洗漆3遍，加入細(xì)胞培養(yǎng)上清，W陰性小鼠血清 作為陰性對(duì)照，lOOul/孔，每個(gè)稀釋度做3個(gè)重復(fù)，37°C解育1~2h，PBST洗漆3遍，加入辣 根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗體，1:5000稀釋?zhuān)琹OOul/孔，37°C解育比，PBST洗漆3遍，加入TMB 顯色液，37°C解育20min，加入終止液，置于酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔0〇45。值，W S/P〉2. 1為陽(yáng)性判斷 標(biāo)準(zhǔn)，標(biāo)記并篩選含有陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)孔； 將篩選得到的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行單克隆化培養(yǎng)，單克隆化培養(yǎng)采用有限稀釋法；首 先，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果，對(duì)細(xì)胞懸液進(jìn)行稀釋?zhuān)蝗?30個(gè)活細(xì)胞懸浮于4. 6ml 的RPMI1640培養(yǎng)基中，此時(shí)，平均每0. 1ml溶液含有5個(gè)細(xì)胞，接種于96孔板，每孔0. 1ml， 共36孔；剩余1ml，再加4mlRPMI 1640培養(yǎng)基，共5ml，此時(shí)，平均每0. 1ml溶液含1個(gè)細(xì)胞， 接種于其次的36孔，每孔0. 1ml ;最后剩余1. 4ml，再補(bǔ)加1. 4ml，共2. 4ml，接種于剩余24 孔，每孔0. 1ml，此時(shí)每孔0. 5個(gè)細(xì)胞；鋪板結(jié)束后，置于顯微鏡下，標(biāo)記出只含有一個(gè)細(xì)胞 的細(xì)胞培養(yǎng)孔； 得到的雜交瘤細(xì)胞穩(wěn)定分泌單克隆抗體，能夠特異性識(shí)別牛乳中的非乳清抗原，且與 羊乳不存在交叉反應(yīng)。
[0005] 步驟二中，所述免疫方案如下： 首次免疫，將脫脂乳與完全弗氏佐劑等體積混勻，形成油包水狀態(tài)，W 100~200ul/只 的劑量免疫小鼠，腹部皮下多點(diǎn)注射； 二免于首免后2周進(jìn)行，將脫脂乳與不完全弗氏佐劑等量混合，形成油包水狀態(tài)，W 100~200ul/只的劑量免疫小鼠，腹部皮下多點(diǎn)注射； S免于二免后2周進(jìn)行，直接注射脫脂乳，50~lOOul/只，腹腔注射； S免后一周，進(jìn)行加強(qiáng)免疫，直接注射脫脂乳，50~lOOul/只，腹腔注射。
[0006] 步驟=中，所述飼養(yǎng)層細(xì)胞的制備方案為： 無(wú)菌條件下，抽取BALB/c小鼠腹腔巨瞻細(xì)胞，鋪于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板備用。
[0007] 通過(guò)步驟四得到單克隆化雜交瘤細(xì)胞后，通過(guò)制備小鼠腹水?dāng)U大培養(yǎng)，包含W下 步驟： 小鼠注射液體石蠟，一周后，每只小鼠注射105個(gè)雜交瘤細(xì)胞細(xì)胞，10~20天，小鼠大 量產(chǎn)生腹水，將抽取的腹水，100化pm離屯、5~lOmin，去除上層油脂及下層沉淀，收集澄清的 腹水，置于-80 °C保存。
[000引如所述的特異性鑒別羊乳中滲加牛乳的單克隆抗體的制備方法制備的單克隆抗 體。
[0009] 本發(fā)明具有W下優(yōu)點(diǎn)： 本發(fā)明W脫脂牛乳為抗原，免疫BALB/c小鼠，分離脾細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合，篩選出具有 穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，所獲單克隆抗體能夠特異性識(shí)別牛乳中的非乳清抗 原，其識(shí)別牛乳的最低限度為0. 2%，且與羊乳不發(fā)生交叉反應(yīng)，可用于開(kāi)發(fā)檢測(cè)試紙條，檢 測(cè)試劑盒等，為開(kāi)發(fā)羊乳中滲加牛乳檢測(cè)試劑盒等檢測(cè)產(chǎn)品奠定基礎(chǔ)。
【具體實(shí)施方式】
[0010] 下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的說(shuō)明。
[0011] 本發(fā)明設(shè)及的特異性鑒別羊乳中滲加牛乳的單克隆抗體的制備方法，包括W下步 驟： 步驟一；制備免疫抗原： 取新鮮牛乳(來(lái)自荷斯坦牛）置于4°c離屯、機(jī)，4000~60(K)巧m，10~20min離屯、；牛乳分 層，上層主要為脂肪，完全棄去，保留并充分混勻剩余部分，即為脫脂乳，作為免疫抗原。
[0012] 步驟二；免疫； 取6-8周齡雌性BALB/c小鼠，利用免疫抗原免疫4次，免疫結(jié)束S天后進(jìn)行細(xì)胞融合。
[0013] 所述免疫方案如下： 首次免疫，將脫脂乳與完全弗氏佐劑等體積混勻，形成油包水狀態(tài)，W 100~200ul/只 的劑量免疫小鼠，腹部皮下多點(diǎn)注射； 二免于首免后2周進(jìn)行，將脫脂乳與不完全弗氏佐劑等量混合，形成油包水狀態(tài)，W 100~200ul/只的劑量免疫小鼠，腹部皮下多點(diǎn)注射； S免于二免后2周進(jìn)行，直接注射脫脂乳，50~lOOul/只，腹腔注射； S免后一周，進(jìn)行加強(qiáng)免疫，直接注射脫脂乳，50~lOOul/只，腹腔注射。
[0014] 步驟S ;制備雜交瘤細(xì)胞： 細(xì)胞融合前一天，制備飼養(yǎng)層細(xì)胞。
[0015] 所述飼養(yǎng)層細(xì)胞的制備方案為： 無(wú)菌條件下，抽取BALB/c小鼠腹腔巨瞻細(xì)胞，鋪于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板備用。
[0016] 細(xì)胞融合于無(wú)菌條件下進(jìn)行，將分離的脾細(xì)胞與SP2/0瘤細(xì)胞按（5-10);1的比例 混合，在PEG1500的作用下進(jìn)行細(xì)胞融合，將融合后的雜交瘤細(xì)胞鋪于含有飼養(yǎng)層細(xì)胞的 96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，置于37°C，5% C〇2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)； 步驟四：篩選雜交瘤細(xì)胞： 按照常規(guī)間接化ISA檢測(cè)雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清；分別用鮮牛乳、鮮羊乳、牛乳清作為包 被抗原，200ul/孔，包被后，4°C過(guò)夜，PBST洗漆3遍，加入細(xì)胞培養(yǎng)上清，W陰性小鼠血清 作為陰性對(duì)照，lOOul/孔，每個(gè)稀釋度做3個(gè)重復(fù)，37°C解育1~2h，PBST洗漆3遍，加入辣 根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗體，1:5000稀釋?zhuān)琹OOul/孔，37°C解育比，PBST洗漆3遍，加入TMB 顯色液，37°C解育20min，加入終止液，置于酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔0〇45。值，WS/P〉2. 1為陽(yáng)性判斷 標(biāo)準(zhǔn)，標(biāo)記并篩選含有陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)孔； 將篩選得到的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行單克隆化培養(yǎng)，單克隆化培養(yǎng)采用有限稀釋法；首 先，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果，對(duì)細(xì)胞懸液進(jìn)行稀釋?zhuān)蝗?30個(gè)活細(xì)胞懸浮于4. 6ml 的RPMI1640培養(yǎng)基中，此時(shí)，平均每0. 1ml溶液含有5個(gè)細(xì)胞，接種于96孔板，每孔0.