新型重組抗蟲蛋白及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及抗蟲蛋白及生物安全技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種新型重組抗蟲蛋白及其 制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 蘇云金芽胞桿菌炬acillus thuringiensis，簡(jiǎn)稱化），化基因即是蘇云金芽胞桿 菌基因，其編碼的化毒蛋白能被蘇云金芽胞桿菌分泌到菌體外，20世紀(jì)50年代中期，科學(xué) 家發(fā)現(xiàn)化毒蛋白對(duì)鱗翅目、銷翅目等昆蟲的毒性來(lái)自于抱子形成過(guò)程中產(chǎn)生的晶體蛋白 質(zhì)，1981年，科學(xué)家提純了該種蛋白質(zhì)并命名為化y，隨后他們克隆出了化y的基因。蘇云 金芽胞桿菌殺蟲晶體蛋白Cry ( W下簡(jiǎn)稱為CiT蛋白）是根據(jù)氨基酸同源性的不同進(jìn)行分 類的；同源性在45% W下，為第一等級(jí)，用阿拉伯?dāng)?shù)字表示；同源性在45%~78%之間，為 第二等級(jí)，用大寫英文字母表示；同源性在78%~95%之間，為第S等級(jí)，用小寫英文字母 表示；同源性在95% W上，為第四等級(jí)，用阿拉伯?dāng)?shù)字表示，例如化ylAclO蛋白。
[000引不同蛋白特異性毒殺昆蟲的種類不同，該主要取決于蛋白與昆蟲中腸道 上皮細(xì)胞膜上的受體相互作用的結(jié)果（Knowles B.等，1993)。相關(guān)的研究表明，化y蛋白的 毒性與毒性膚和膜受體的結(jié)合力呈正相關(guān)Olofmann C.等，1989)，一般是化y蛋白W原毒 素的形式存在，在堿性條件下溶解，在蛋白酶作用下水解掉C端非活性部位而變成活性毒 性膚，此活化的毒性膚與昆蟲中腸道膜上的受體結(jié)合，毒性區(qū)結(jié)構(gòu)域I的a螺旋使膜穿孔， 從而破壞膜細(xì)胞的滲透平衡；結(jié)構(gòu)域II具有與中腸道上皮細(xì)胞膜結(jié)合的能力，與受體結(jié)合 W及決定祀標(biāo)昆蟲特異性；結(jié)構(gòu)域III為穩(wěn)定與毒素受體的結(jié)合、決定特異性W及口控離 子通道，可應(yīng)用于人為的化y蛋白分子改造，改造可能會(huì)影響到對(duì)毒素受體的識(shí)別，改變親 代毒蛋白的抗蟲譜及抗蟲活力。
[0004] 1991年，化rlak等人通過(guò)兩種方法對(duì)hylAb蛋白進(jìn)行改造，其一是在不改變 化ylAb蛋白氨基酸順序的基礎(chǔ)上，通過(guò)點(diǎn)突變方法對(duì)化ylAb蛋白進(jìn)行部分改造，即改變 3%堿基序列，其二是在保持化ylAb蛋白活性中屯、與結(jié)構(gòu)的前提下，按照高等植物所偏愛 密碼子的原則，通過(guò)人工合成方法對(duì)hylAb蛋白進(jìn)行完全改造，即改變21 %堿基序列。 1995年，Ballcster等人發(fā)現(xiàn)對(duì)甜菜夜蛾沒有毒性的化ylE蛋白和化ylAb蛋白，兩者的結(jié) 構(gòu)域III分別被具有毒性的化ylC蛋白的結(jié)構(gòu)域III取代后都具有了毒性；對(duì)煙芽夜蛾低 毒的化ylAa蛋白的結(jié)構(gòu)域III被毒性更高的化ylAc蛋白的結(jié)構(gòu)域III置換后，能夠增加 化ylAa蛋白的毒性。2006年，郭青云等人通過(guò)體外重組的方法實(shí)現(xiàn)了化ylAa蛋白和化yl化 蛋白的功能性結(jié)構(gòu)域I、II、III互換，得到了 6株蘇云金芽抱桿菌重組菌株，經(jīng)過(guò)對(duì)各雜交 殺蟲晶體蛋白獨(dú)立測(cè)定，發(fā)現(xiàn)比野生型殺蟲晶體蛋白毒力減弱，從而證明了殺蟲晶體蛋白 不同結(jié)構(gòu)域的相互作用會(huì)影響雜交殺蟲晶體蛋白的表達(dá)、晶體形態(tài)和殺蟲活性。
[000引化y蛋白家族中，化ylAb蛋白、化ylAc蛋白和化y9C蛋白對(duì)亞洲玉米懼的殺蟲活 性最強(qiáng)，商品化轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米中主要應(yīng)用編碼上述S種蛋白的化ylAb基因XrylAc基因 和&y9C基因。目前，基因的獲得主要是從天然蘇云芽抱桿菌或自然宏基因組文庫(kù)中 克隆，并進(jìn)一步利用大腸桿菌表達(dá)、抗蟲性鑒定等研究策略高通量篩選新型抗蟲基因。物種 之間通過(guò)不斷的加速進(jìn)化競(jìng)爭(zhēng)性生存，W病毒蛋白進(jìn)化為例，進(jìn)化率越快的病毒蛋白具有 越高的與宿主蛋白結(jié)合的能力，即；侵染能力越強(qiáng)。但由于自然界菌株變異速率相對(duì)較慢， 獲得更高抗蟲性的化y蛋白越來(lái)越困難，因此，獲得進(jìn)化率快的化y基因?qū)τ诟呖瓜x材料的 獲得至關(guān)重要。
[0006] 通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)，可W將抗蟲基因?qū)胗衩灼贩N中，進(jìn)而提高轉(zhuǎn)基因玉米的抗蟲 性，降低農(nóng)藥的使用量，節(jié)省人力、物力及社會(huì)資源。因此，應(yīng)用新的高抗昆蟲蛋白、提高殺 蟲蛋白的表達(dá)量W及培育新型轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米是解決上述問題的最有效途徑之一。美國(guó)的 科學(xué)家把基因轉(zhuǎn)入玉米和棉花中，轉(zhuǎn)基因玉米和棉花在美國(guó)成功地上市，至今未發(fā)現(xiàn) 它們對(duì)人類有任何負(fù)面影響，該種轉(zhuǎn)基因作物對(duì)于環(huán)境的貢獻(xiàn)是巨大的。在中國(guó)，也有許多 科學(xué)家在致力于轉(zhuǎn)化基因玉米的研究。中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)的王國(guó)英教授研究的轉(zhuǎn)化基因玉米 已經(jīng)在國(guó)內(nèi)進(jìn)行了環(huán)境釋放。轉(zhuǎn)化基因玉米在中國(guó)的商業(yè)推廣將給玉米生產(chǎn)和種植者帶 來(lái)極大的收益。中國(guó)自2008年國(guó)家啟動(dòng)《轉(zhuǎn)基因生物新品種培育科技重大專項(xiàng)》后，在轉(zhuǎn) 基因抗蟲玉米品種培育方面雖有些報(bào)道，但卻沒有能夠最終商業(yè)化，該主要?dú)w結(jié)于化基因 的抗蟲效果及轉(zhuǎn)化植株的穩(wěn)定性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 為了獲得更高抗蟲活性的抗蟲蛋白，本發(fā)明提供一種新型重組抗蟲蛋白及其制備 方法和應(yīng)用。
[000引本發(fā)明提供的一種新型重組抗蟲蛋白，該蛋白的氨基酸序列如序列表中的SEQ ID NO: 1所示，編碼該蛋白的抗蟲基因NGc的核巧酸序列如序列表中的SEQ ID NO:2所示。
[0009] 本發(fā)明還提供一種含有上述抗蟲基因NGc的植物表達(dá)NGc蛋白載體 pTFlOl. 1-ubi-NGc，該載體的核巧酸序列如序列表中的SEQ ID N0:3所示。
[0010] 進(jìn)一步的，通過(guò)對(duì)載體pTFlOl進(jìn)行改造來(lái)構(gòu)建植物表達(dá)NGc蛋白載體 pTFlOl. 1-ubi-NGc ;在載體pTFlOl原有架構(gòu)的基礎(chǔ)上，選擇除草劑抗性基因bar為篩選標(biāo) 記基因，由啟動(dòng)子2XP35S驅(qū)動(dòng)，由終止子Tvsp終止篩選標(biāo)記基因bar轉(zhuǎn)錄；由啟動(dòng)子ubi 啟動(dòng)抗蟲基因NGc表達(dá)，由終止子nos終止抗蟲基因NGc轉(zhuǎn)錄，通過(guò)啟動(dòng)子ubi驅(qū)動(dòng)將抗蟲 基因NGc分別連接入載體pTFlOl的Smal位點(diǎn)和SacI位點(diǎn)，構(gòu)建植物表達(dá)NGc蛋白載體 pTFlOl. 1-ubi-NGco
[001U 進(jìn)一步的，所構(gòu)建的植物表達(dá)NGc蛋白載體pTFlOl. l-ubi-NGc包括；
[001引啟動(dòng)子ubi,為玉米基因組基因ubi,長(zhǎng)2022bp，負(fù)責(zé)啟動(dòng)抗蟲基因NGc表達(dá)；
[0013] 終止子nos,為根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒T-DNA區(qū)姻脂堿合成酶基因，長(zhǎng)268bp，負(fù)責(zé)終 止抗蟲基因NGc轉(zhuǎn)錄；
[0014] 篩選標(biāo)記基因bar,為除草劑抗性基因bar,來(lái)源于吸水鏈霉素，編碼區(qū)55化P，編 碼184個(gè)氨基酸；
[0015] 啟動(dòng)子2XP35S，來(lái)自花挪菜花葉病毒CaMV，長(zhǎng)663bp，負(fù)責(zé)啟動(dòng)篩選標(biāo)記基因bar 表達(dá)；
[0016] 終止子Tvsp,長(zhǎng)65化P，負(fù)責(zé)終止篩選標(biāo)記基因bar轉(zhuǎn)錄。
[0017] 本發(fā)明還提供了上述新型重組抗蟲蛋白的制備方法，該方法通過(guò)W下步驟實(shí)現(xiàn)：
[001引步驟一、化y蛋白家族改造區(qū)域的確定
[0019] 從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中查找蛋白家族中&ylA105蛋白、hylAal蛋白、hylAbl蛋 白、CrylAbS 蛋白、CrylAbH 蛋白、CrylAcl 蛋白、CrylAhl 蛋白、CrylBal 蛋白、CrylBbl 蛋 白、CrylBel 蛋白、CrylBfl 蛋白、CrylFal 蛋白、CrylGc 蛋白、Cryllal 蛋白、Cryllfl 蛋白、 Cryljal 蛋白、Cryljbl 蛋白、Cryljcl 蛋白、Cry2Abl 蛋白、Cry2Acl 蛋白、Cry2Ael 蛋白、 化y9Aal蛋白、化y9Cal蛋白、化y犯cl蛋白的氨基酸序列；利用pMAL算法和perl編程語(yǔ) 言，采用進(jìn)化率分析方法，確定在分子進(jìn)化過(guò)程中蛋白氨基酸序列的高進(jìn)化活性區(qū)域；
[0020] 將分析得到的高進(jìn)化活性區(qū)域分為區(qū)域A~F，區(qū)域A為氨基酸位點(diǎn)在36~120 之間，區(qū)域B為氨基酸位點(diǎn)在121~254之間，區(qū)域C為氨基酸位點(diǎn)在255~360之間，區(qū) 域D為氨基酸位點(diǎn)在361~461之間，區(qū)域E為氨基酸位點(diǎn)在462~539之間，區(qū)域F為氨 基酸位點(diǎn)在540~606之間，化y蛋白的氨基酸序列中共有150個(gè)位點(diǎn)的氨基酸殘基具有 進(jìn)化活性，即位點(diǎn)Ka/Ks〉l，Ka為氨基酸突變率，Ks為同義突變率，其中進(jìn)化活性較高的位 點(diǎn)有45個(gè)，即位點(diǎn)Ka/Ks〉l. 45,該45個(gè)位點(diǎn)的氨基酸殘基分布為：區(qū)域A有1個(gè)高進(jìn)化活 性的氨基酸殘基，區(qū)域B有2個(gè)高進(jìn)化活性的氨基酸殘基，區(qū)域C有12個(gè)高進(jìn)化活性的氨 基酸殘基，區(qū)域D有3個(gè)高進(jìn)化活性的氨基酸殘基，區(qū)域E有16個(gè)高進(jìn)化活性的氨基酸殘 基，區(qū)域F有11個(gè)高進(jìn)化活性的氨基酸殘基，因此，區(qū)域A和區(qū)域B均為保守區(qū)域，區(qū)域C、 區(qū)域D、區(qū)域E和區(qū)域F為高進(jìn)化活性區(qū)域；
[0021] 步驟二、構(gòu)建新型抗蟲基因庫(kù)
[0022] (1)選取NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中具有抗鱗翅目蟲活性的基因建立數(shù)據(jù)集，通過(guò)BLAST進(jìn)行 局部相似性比對(duì)；
[0023] 根據(jù)四級(jí)核巧酸同源性差異選擇基因：
[0024] CrylAbl基因、CrylAbS基因、CrylAbH基因；核巧酸同源性大于95% ;
[002引 CrylAb基因、CrylAc基因、CrylAh基因；核巧酸同源性在78%~95%之間；
[0026] 化ylA基因、化ylB基因、化ylF基因、化ylG基因、化yll基因、化ylj基因；核巧酸 同源性在45 %~78 %之間；
[0027] 基因、基因、&y9基因；核巧酸同源性低于45%;
[002引 （2)采用最大簡(jiǎn)約法建立系統(tǒng)進(jìn)化樹；首先采用Clustalx2. 0軟件對(duì)所選的化y 基因進(jìn)行多重比對(duì)，再利用MEGA 5軟件建立取代模型，同時(shí)建立化y蛋白氨基酸序列系統(tǒng) 進(jìn)化樹并評(píng)估系統(tǒng)進(jìn)化樹；
[0029] (3)根據(jù)系統(tǒng)進(jìn)化樹上顯示的氨基酸序列進(jìn)化親緣關(guān)系，選擇核巧酸同源性在 78 %~95 %之間的基因，即選取CrylAb基因、CrylAc基因、CryIBa基因、CryIGc基因、 hylla基因、hyljb基因、&y2Ae基因、&y9化基因作為代表，從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中查找 CrylAb 基因、CrylAc 基因、CrylBa 基因、CrylGc 基因、Crylla 基因、CryUb 基因、Cry2Ae 基因、化y9化基因的編碼序列；
[0030] (4)區(qū)域A和區(qū)域B均為保守區(qū)域，將區(qū)域A和區(qū)域B合成為一個(gè)區(qū)域A+B，選取 化ylAb基因作為區(qū)域A+B的供體，合成化ylAb基因N端區(qū)域A+B的編碼序列，獲得長(zhǎng)度為 1~1410bp的基因片段，編碼N端1~470個(gè)氨基酸；
[0031] 區(qū)域C、區(qū)域D、區(qū)域E和區(qū)域F均為高進(jìn)化活性區(qū)域，將區(qū)域C和區(qū)域D合成為一 個(gè)區(qū)域C+D，將區(qū)域E和區(qū)域F合成為一個(gè)區(qū)域E