一株生物農(nóng)藥武夷菌素的高產(chǎn)菌株w-273及其應用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一株武夷菌素高產(chǎn)菌株及其應用。
【背景技術(shù)】
[0002] 生物農(nóng)藥是農(nóng)作物病蟲害生物防治的重要手段，具有安全、高效和環(huán)境友好的 特點，其中農(nóng)用抗生素在生物農(nóng)藥占重要的地位。武夷菌素是由不吸水鏈霉菌武夷變種 (Streptomyces anhygroscopicus var. wuyiensis)產(chǎn)生的一種高效、廣譜、低毒、與環(huán)境相 容性好的農(nóng)用抗生素，主要用于防治農(nóng)作物真菌病害。2000年武夷菌素獲得國家五部委頒 發(fā)的"國家重點新產(chǎn)品"證書（2000G041B326001)。2001年武夷菌素被列入露地、保護地 無公害番茄生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程（農(nóng)業(yè)行業(yè)標準NY/T5006-2001、NY/T5074-2002)，全國多個省 市（自治區(qū)）也將該技術(shù)列入無公害黃瓜、辣椒、草莓、茄子生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程。2009年武夷菌 素又被列入蔬菜病蟲害安全防治技術(shù)規(guī)范（國家標準），指定用于防治茄果類、瓜類、綠葉 類蔬菜白粉病、灰霉病、葉霉病等多種病害。2010年武夷菌素產(chǎn)品獲得國家有機產(chǎn)品認證 (C0FCC-R-0903-0070)。目前，武夷菌素的應用已經(jīng)成為我國無公害蔬菜和有機蔬菜生產(chǎn)中 防治病害的核心技術(shù)。
[0003] 提高防病效果和降低生產(chǎn)成本是武夷菌素產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)和大面積推廣面臨的主要 問題。武夷菌素生產(chǎn)方法主要包括產(chǎn)生菌二級發(fā)酵培養(yǎng)、有效成分提取和產(chǎn)品加工三個主 要步驟，因此，篩選武夷菌素高產(chǎn)菌株，同時改進高產(chǎn)菌株的培養(yǎng)條件對于降低生產(chǎn)成本起 著重要作用。由于采用原來武夷菌素產(chǎn)生菌及培養(yǎng)基配方發(fā)酵生產(chǎn)武夷菌素效價較低、生 產(chǎn)成本高，嚴重影響武夷菌素的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。
[0004] 因此，選育武夷菌素高產(chǎn)菌株W-273并改進該高產(chǎn)菌株培養(yǎng)條件，對于提高武夷 菌素產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)水平和增強產(chǎn)品在農(nóng)業(yè)市場的競爭力具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一株生物農(nóng)藥武夷菌素的高產(chǎn)菌株及其在發(fā)酵生產(chǎn)的應用。
[0006] 本發(fā)明所提供的武夷菌素高產(chǎn)菌株，具體為不吸水鏈霉菌武夷變種 (Streptomyces ahygroscopicus var. wuyiensis) W-273。該菌株是從武夷菌素生物合成正 調(diào)控基因 wysR過表達菌株的單菌落中篩選得到的新菌株，研宄表明，W-273菌株在MS培養(yǎng) 基上較原始菌株CK-15生長迅速，產(chǎn)孢時間早且產(chǎn)孢量增加。該菌株已于2014年8月26 日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（簡稱CGMCC，地址為：北京市朝 陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研宄所），保藏登記號為CGMCC No. 9604。
[0007] 本發(fā)明的再一個目的是提供一種菌劑。
[0008] 本發(fā)明所提供的菌劑的活性成分為所述不吸水鏈霉菌武夷變種（Streptomyces ahygroscopicus var. wuyiensis)W-273CGMCC No. 9604〇
[0009] 所述不吸水鏈霉菌武夷變種（Streptomyces ahygroscopicus var. wuyiensis) W-273CGMCC No. 9604或所述菌劑在制備武夷菌素中的應用也屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0010] 本發(fā)明的還一個目的是提供一種制備武夷菌素的方法。
[0011] 本發(fā)明所提供的制備武夷菌素的方法，具體可包括如下步驟：發(fā)酵培養(yǎng)所述 不吸水鏈霉菌武夷變種（Streptomyces ahygroscopicus var.wuyiensis)W_273CGMCC No. 9604,收集發(fā)酵產(chǎn)物，獲得武夷菌素。
[0012] 在上述方法中，所述發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)基的溶劑為水，溶質(zhì)及其濃度為玉米粉30mg/ ml、黃豆粉 20mg/ml、葡萄糖 39mg/ml、氯化按 4mg/ml、碳酸 1? 2. 65mg/ml、氯化鎂 0· 4mg/ml ; pH6. 89〇
[0013] 在上述方法中，所述發(fā)酵培養(yǎng)可為搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)；所述搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)時間 可為48~72h (如60h);所述搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)溫度可為26~30°C (如28°C);所述搖 瓶發(fā)酵培養(yǎng)的震蕩轉(zhuǎn)速可為180~220rpm(如220rpm)。
[0014] 在上述方法中，所述發(fā)酵培養(yǎng)也可為發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)；所述發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)的 培養(yǎng)溫度可為26~30°C (如28°C );所述發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)過程中的罐壓可為0. 02~ 0.1 OMPa(如0. 05MPa)。所述發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)過程中的攪拌轉(zhuǎn)速可為50~300rpm(如 220rpm)。
[0015] 所述發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)可為一級發(fā)酵或二級發(fā)酵；
[0016] 當所述發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)為一級發(fā)酵時，培養(yǎng)時間為45~100小時（如60小時）；
[0017] 當所述發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)為二級發(fā)酵時，兩次發(fā)酵培養(yǎng)時間依次為16~45小時 (如18小時）、30~80小時（如60小時）。
[0018] 本發(fā)明的又一個目的是提供所述菌劑的制備方法。
[0019] 所述菌劑的制備方法，具體可包括如下步驟：將所述不吸水鏈霉菌武夷變種 (Streptomyces ahygroscopicus var.wuyiensis)W_273CGMCC No. 9604 作為活性成分，得 到所述菌劑。
[0020] 所述不吸水鏈霉菌武夷變種（Streptomyces ahygroscopicus var. wuyiensis) W-273CGMCC No. 9604的發(fā)酵液或所述發(fā)酵液的過濾液也屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0021] 本發(fā)明以不吸水鏈霉菌武夷變種（Streptomyces ahygroscopicus var. wuyiensis)CK-15為出發(fā)菌株，對其進行代謝工程改造，篩選得到不吸水鏈霉菌武夷變種 (Streptomyces ahygroscopicus var. wuyiensis) W-273CGMCC No. 9604。發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng) 該菌株，發(fā)現(xiàn)其產(chǎn)武夷菌素的量達到6500-7500 μ g/mL發(fā)酵液，較出發(fā)菌株CK-15提高了約 132-317%，該菌株具有廣闊工業(yè)應用的前景。
[0022] 保藏說明
[0023] 菌種名稱：不吸水鏈霉菌武夷變種
[0024] 拉丁名：（Streptomyces ahygroscopicus var. wuyiensis)
[0025] 菌株編號：W-273
[0026] 保藏機構(gòu)：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心
[0027] 保藏機構(gòu)簡稱：CGMCC
[0028] 地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號
[0029] 保藏日期：2014年8月26日
[0030] 保藏中心登記入冊編號：CGMCC No. 9604
【附圖說明】
[0031] 圖1為高產(chǎn)菌株W-273和原始菌株CK-15在MS培養(yǎng)基培養(yǎng)不同天數(shù)觀察結(jié)果。
[0032] 圖2為高產(chǎn)菌株W-273和原始菌株CK-15培養(yǎng)不同天數(shù)顯微鏡觀察結(jié)果（100X)。
[0033] 圖3為高產(chǎn)菌株W-273和原始菌株CK-15培養(yǎng)不同天數(shù)顯微鏡觀察結(jié)果 (1000X) 〇
[0034] 圖4為高產(chǎn)菌株W-273和原始菌株CK-15孢子電鏡掃描對比圖。a(4.0kX)和 八(15.01^\)為高產(chǎn)菌株1-273山(4.(^\)和8(15.(^\)為原始菌株〇(-15。
[0035] 圖5為高產(chǎn)菌株W-273和原始菌株CK-15不同發(fā)酵時間菌絲體生長情況。
[0036] 圖6為高產(chǎn)菌株W-273和原始菌株CK-15不同發(fā)酵時間發(fā)酵液總糖含量。
[0037] 圖7為高產(chǎn)菌株W-273和原始菌株CK-15不同發(fā)酵時間發(fā)酵液效價。
【具體實施方式】
[0038] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0039] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0040] 不吸水鏈霉菌武夷變種（Streptomyces ahygroscopicus var. wuyiensis) CK-15 : 記載于"王萬群，武夷菌素產(chǎn)生菌CK-15細菌人工染色體（BAC)文庫構(gòu)建，2008. 6. 1" 一文 中。公眾可從中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研宄所獲得。
[0041] 深紅酵母AS2. 282 (Rhodotorula rubra):武夷菌素生物效價測定用指示菌，載于 "曾洪梅林德忻石義萍，農(nóng)抗武夷菌素產(chǎn)生菌原生質(zhì)體誘變育種.中國生物防治，1996年01 期，48-49. " 一文中。
[0042] 實施例1、不吸水鏈霉菌武夷變種（Streptomyces ahygroscopicus var. wuyiensis)W-273 的獲得
[0043] -、武夷菌素過表達菌株群體的構(gòu)建
[0044] 從原始菌株不吸水鏈霉菌武夷變種（Streptomyces ahygroscopicus var. miyienSiS)CK-15中得到一個武夷菌素生物合成正調(diào)控基因 wysR，將該基因克隆至具有強 啟動子PsnJ^pSETC載體上，轉(zhuǎn)移至原始菌株CK-15中，構(gòu)建了過表達菌株群體（具體參見 專利申請?zhí)枮?01310566436. 2的中國專利申請）。
[0045] 二、武夷菌素高產(chǎn)菌株的篩選
[0046] (1)培養(yǎng)過表達菌株單菌落：將步驟一構(gòu)建的過表達菌株群體菌種菌液均勻涂布 于MS培養(yǎng)基平板上，28°C培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)，至單菌落產(chǎn)生灰色孢子。
[0047] (2)瓊脂塊法初篩：用打孔器打出單菌落瓊脂塊，挑取菌塊放置于PDA平板上，按 一定距離擺放，有菌一面朝上，28°C恒溫培養(yǎng)。挑選出抑菌圈直徑明顯較大的幾株菌株，用 滅菌牙簽挑孢子接種于MS平板上劃線培養(yǎng)，準備進行搖瓶發(fā)酵復篩。
[0048] (3)搖瓶發(fā)酵復篩：待平板表面產(chǎn)生大量孢子時，將初篩得到的幾個菌株進行發(fā) 酵培養(yǎng)，得到發(fā)酵液采用杯碟法對紅酵母AS2. 282抑菌效果測定，篩選得到幾株最優(yōu)菌株。
[0049] (4)遺傳穩(wěn)定性實驗：將經(jīng)初篩和復篩選出的高產(chǎn)菌株，接種于MS平板培養(yǎng)基上 進行傳代培養(yǎng)，傳代培養(yǎng)5次，并對各代菌株進行搖瓶發(fā)酵實驗，管碟法測效價，分析比較 菌株遺傳穩(wěn)定性，確定最優(yōu)高產(chǎn)菌株。
[0050] 最終獲得一株可以穩(wěn)定高產(chǎn)武夷菌素的不吸水鏈霉菌武夷變種（Streptomyces ahygroscopicus var.wuyiensis)菌株，其編號為 W_273〇
[0051] 該菌株已于2013年8月26日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微 生物中心（簡稱CGMCC，地址為：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號），保藏編號為CGMCC No.9604。
[0052] 實施例2、不吸水鏈霉菌武夷變種（Streptomyces ahygroscopicus var. wuyiensis)W-273CGMCC No. 9604 的鑒定
[0053] 一、生理形態(tài)特征鑒定
[0054] 1、實驗方法
[0055] 將滅菌MS培養(yǎng)基熔化后倒入直徑90mm培養(yǎng)皿中，盡量使培養(yǎng)基厚一些，劃線接 種不吸水鏈霉菌武夷變種（Streptomyces ahygroscopicus var.wuyiensis)W-273CGMCC No. 9604和原始菌株CK-15,將無菌蓋玻片以45°角插入平板培養(yǎng)基，與劃線垂直，28°C恒 溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)；光學顯微鏡鏡檢時用鑷子小心拔出蓋玻片，有菌的一面朝下放在載玻片上 直接觀察即可；電子顯微鏡鏡檢時先將蓋玻片放入2~4%戊二醛固定液中固定1~2天， 0.1 M pH7. 2PBS緩沖液洗，用1% OsO4后固定1~2小時，再用重蒸水沖洗30分鐘，隨后用 30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%乙醇梯度脫水，每級15~20分鐘，樣品脫水后用 醋酸異戊酯處理，CO 2臨界點干燥，干燥好的樣品粘貼在樣品臺上，用離子濺射儀表面噴金， 噴金后樣品在掃描電鏡下掃描，拍照并記錄。每天取蓋玻片在光學顯微鏡下觀察菌絲和孢 子生長情況，待產(chǎn)生大量孢子后再電子顯微鏡下觀察孢子形態(tài)。
[0056] 2、結(jié)果
[0057] 將實施例1獲得的不吸水鏈霉菌武夷變種（Streptomyces ahygroscopicus va