一種普魯蘭酶產(chǎn)酶菌株及提高其產(chǎn)酶能力的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種普魯蘭酶產(chǎn)酶菌株、提高其產(chǎn)酶能 力的方法及所構(gòu)建的新的高產(chǎn)普魯蘭酶工程菌株。
【背景技術(shù)】
[0002] 自然界和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)形成的糖質(zhì)原料絕大多數(shù)是以多糖形式存在的，包括淀粉質(zhì)原 料(玉米、小麥、薯類等)、木質(zhì)纖維素(秸桿、林木等）和殼聚糖（昆蟲、蝦蟹外殼）等。由于種 種原因，目前能夠被有效利用的主要是淀粉質(zhì)原料。我國食品和發(fā)酵行業(yè)每年耗用玉米、大 米、小麥和薯類等淀粉質(zhì)原料達(dá)5000余萬噸。
[0003] 淀粉質(zhì)原料用于食品與發(fā)酵生產(chǎn)時(shí)往往需要經(jīng)過酶解生成葡萄糖。淀粉酶解所用 的酶有α -淀粉酶、糖化酶、普魯蘭酶、β -淀粉酶和異淀粉酶等。其中α -淀粉酶、糖化酶只 能水解淀粉中直鏈部分的α -1，4糖苷鍵，不能水解淀粉中支鏈淀粉分支點(diǎn)中的α -1，6-糖 苷鍵。異淀粉酶雖然能水解分支淀粉分支點(diǎn)的α-1，6糖苷鍵，但是不能水解由2~3個(gè)葡 萄糖殘基構(gòu)成的側(cè)枝。普魯蘭酶不僅能夠?qū)Ｒ恍缘厮庵ф湹矸鄯种c(diǎn)中的α-1，6糖苷 鍵，并能將最小單位的支鏈分解，最大限度的利用淀粉原料。因此，在淀粉糖化階段普魯蘭 酶與糖化酶一起使用，可大幅度提高液化后淀粉的水解速度，降低糖化酶用量，縮短糖化時(shí) 間，提高淀粉原料利用率，節(jié)能減排，減污增效，對(duì)提高食品和發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)技術(shù)水平和經(jīng) 濟(jì)社會(huì)效益具有非常重要的意義。
[0004] 現(xiàn)有技術(shù)中，我國普魯蘭酶市場被少數(shù)大型跨國公司所壟斷，酶的價(jià)格昂貴，難以 滿足國內(nèi)食品與發(fā)酵等行業(yè)的迫切需要。盡管我國在普魯蘭酶產(chǎn)生菌資源篩選和分子改 造及基因工程等方面的研宄取得了一定的進(jìn)展，但無論是從自然界篩選的菌株還是工程菌 株，均存在酶活力低、酶學(xué)性質(zhì)差等問題，至今尚未實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，因而尚需進(jìn)一步探索 研宄。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明主要目的在于提供一種普魯蘭酶產(chǎn)酶菌株，同時(shí)提供了一種提高普魯蘭酶 產(chǎn)酶菌株產(chǎn)酶能力的方法，該方法通過將枯草芽孢桿菌Ρ43啟動(dòng)子轉(zhuǎn)化進(jìn)入普魯蘭酶產(chǎn)酶 原始菌株，即可實(shí)現(xiàn)普魯蘭酶酶活和相關(guān)基因表達(dá)量的大幅提高。
[0006] 本發(fā)明的技術(shù)方案如下。
[0007] -種魯蘭酶產(chǎn)酶菌株，該菌株名稱為變棲克雷伯氏菌ΗΝ7, variicola HN7,已于2015年1月14日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址： 北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，保藏編號(hào)為：CGMCC NO. 10357。
[0008] -種提高魯蘭酶產(chǎn)酶菌株產(chǎn)酶能力的方法，通過在菌株中轉(zhuǎn)入枯草芽孢桿菌P43 啟動(dòng)子以提高其產(chǎn)酶能力，具體包括以下步驟： (1)提取DNA，將枯草芽孢桿菌進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，然后離心收集菌體，按照Ezup柱式細(xì)菌 基因組DNA提取試劑盒的說明書提取所培養(yǎng)菌體的DNA ; (2) PCR擴(kuò)增，PCR分別擴(kuò)增四環(huán)素抗性基因 Tfei上游片段、四環(huán)素抗性基因 Tfei下游 片段、枯草芽孢桿菌P43啟動(dòng)子，具體如下： PCR擴(kuò)增四環(huán)素抗性基因 Tfei上游片段時(shí)，引物序列設(shè)計(jì)如下： 上游片段的引物 Tet-Fl :5' -GGGGGATGATTGCGCCCCGGAAAGCAAAAATATCTAATTAAATTCTCA TGTTTGACAGCTTATCATCG-3'， 引物 Tet-Rl :5' -GCCGAAAATGACCCAGAGCGCTGCCGGCACCTGTCCTACGAGTTGCATGATAAAGAAG ACAGTC-3' ； PCR擴(kuò)增時(shí)，以pBR322質(zhì)粒為模板，擴(kuò)增產(chǎn)物記錄為第一片段，4°C保存?zhèn)溆茫?PCR擴(kuò)增四環(huán)素抗性基因 Tfei下游片段時(shí)，引物序列設(shè)計(jì)如下： 下游片段引物 Tet-F2 : 5' -CGTAGGACAGGTGCCGGCAGCGCTCTGGGTCAITTTCGGCGAGGACCGC TTTCGCTGGAG-3'， 引物 Tet-R2 :5' -CCTGCATGCACGTCGACACGAGATGCGCCGCGT-3' ； PCR擴(kuò)增時(shí)，以pBR322質(zhì)粒為模板，擴(kuò)增產(chǎn)物記錄為第二片段，4°C保存?zhèn)溆茫?PCR擴(kuò)增枯草芽孢桿菌P43啟動(dòng)子時(shí)，引物序列設(shè)計(jì)如下： 上游引物為 PF3 :5' -ACGCGGCGCATCTCGTGTCGACGTGCATGCAGG-3'， 下游引物為 PR3 :5' -TCCAAGGTAATAGGGCATGACAGGTATATCTGAGCATCGATATAATGGTACCGCT ATCACTT-3' ； PCR擴(kuò)增時(shí)，以枯草芽孢桿菌基因組DNA為模板，擴(kuò)增產(chǎn)物記錄為第三片段，4°C保存?zhèn)?用； (3) PCR融合，將步驟（2)中分別擴(kuò)增的序列片段采用融合PCR技術(shù)進(jìn)行融合，具體順序 為：第一輪PCR將第一片段與第二片段進(jìn)行融合，第二輪PCR時(shí)加入第三片段，第三輪PCR 以步驟（2)中的Tet-Fl與pR3作為引物序列進(jìn)行整體擴(kuò)增； 切膠純化后獲得同源重組片段； (4) 電擊轉(zhuǎn)化，將步驟（3)純化并驗(yàn)證序列正確的同源重組片段采用電擊轉(zhuǎn)化方式轉(zhuǎn)化 普魯蘭酶產(chǎn)酶原始菌株，例如變棲克雷伯氏菌HN7 rariicoh HN7)，電擊轉(zhuǎn) 化液轉(zhuǎn)移至新鮮的LB培養(yǎng)基，復(fù)蘇后均勻的涂在含有四環(huán)素的抗性LB平板中培養(yǎng)過夜； (5) 轉(zhuǎn)化子篩選鑒定，挑選步驟（4)中四環(huán)素抗性LB平板中陽性單克隆菌落，提取DNA， PCR鑒定，鑒定正確菌株即可用于普魯蘭酶發(fā)酵生產(chǎn)。
[0009] 采用上述方法所構(gòu)建的高產(chǎn)普魯蘭酶工程菌，普魯蘭酶產(chǎn)酶原始菌株為變棲克雷 伯氏菌 HN7 (HN7 )。
[0010] 現(xiàn)有技術(shù)中，針對(duì)普魯蘭酶工程菌篩選工作，已有較多實(shí)踐，例如克雷伯氏菌Z-13 rariico/a)(王明道等，一株產(chǎn)普魯蘭酶細(xì)菌的分離鑒定及其發(fā)酵條件優(yōu) 化，信陽師范學(xué)院學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2014, 27 (4) :569~573)，其原始產(chǎn)酶能力僅為5. 7 U/ mL，尚不能用于生產(chǎn)實(shí)踐；而本發(fā)明所提供的變棲克雷伯氏菌HN7 HN7)，其原始產(chǎn)酶能力已可達(dá)7. 2 U/mL，進(jìn)一步改進(jìn)提高其產(chǎn)酶能力后即可用于生產(chǎn)實(shí)踐。 [0011] 現(xiàn)有技術(shù)中，采用基因工程構(gòu)建高產(chǎn)普魯蘭酶工程菌株時(shí)，一般通過質(zhì)粒載體方 式將普魯蘭酶轉(zhuǎn)化進(jìn)入新的微生物表達(dá)系統(tǒng)，然后通過誘導(dǎo)表達(dá)、純化等方式獲得普魯蘭 酶，這種方法存在外源表達(dá)、提取、純化操作復(fù)雜等弊端。而本發(fā)明通過基因工程技術(shù)將枯 草芽孢桿菌P43啟動(dòng)子轉(zhuǎn)化進(jìn)入產(chǎn)普魯蘭酶原始菌株，操作方式易于實(shí)現(xiàn)。由于普魯蘭酶 得以在本體內(nèi)得到表達(dá)，合成和分泌途徑?jīng)]有發(fā)生改變，不會(huì)發(fā)生質(zhì)粒丟失現(xiàn)象，因而遺傳 穩(wěn)定性高；而且本發(fā)明通過以變棲克雷伯氏菌HN7 (Z/e/wieBa rariicoh HN7)作為原 始出發(fā)菌株進(jìn)行了具體驗(yàn)證，表明普魯蘭酶的酶活和酶表達(dá)量具有較好的提高，因而具有 較好的推廣應(yīng)用價(jià)值。
【附圖說明】
[0012] 圖1為初步篩選過程中所篩選出的變棲克雷伯氏菌HN7 (菌種鑒定后命名為變棲 克雷伯氏菌HN7,鑒定前僅標(biāo)記為代號(hào)HN7)的培養(yǎng)圖； 圖2所篩選出的變棲克雷伯氏菌HN7 (菌種鑒定后命名為變棲克雷伯氏菌HN7,鑒定前 僅標(biāo)記為代號(hào)HN7)的HN 7菌落形態(tài)（圖A)及革蘭氏染色圖（圖B); 圖3為PCR擴(kuò)增四環(huán)素抗性基因 Tfei的上、下游片段和枯草芽孢桿菌P43啟動(dòng)子片段 產(chǎn)物電泳圖譜，其中1為四環(huán)素抗性基因 Tfei的上游片段；2為四環(huán)素抗性基因 Tfei的下游 片段；3為枯草芽孢桿菌P43啟動(dòng)子片段； 圖4為PCR融合后同源重組片段，其中1為同源重組片段； 圖5為同源重組片段轉(zhuǎn)化克雷伯氏菌后重新PCR擴(kuò)增出的同源重組片段的PCR電泳檢 測結(jié)果； 圖6為同源重組片段轉(zhuǎn)化克雷伯氏菌后重新PCR擴(kuò)增出同源重組片段部分序列及變棲 克雷伯氏菌上游基因組序列的PCR檢測結(jié)果； 圖7為同源重組片段轉(zhuǎn)化克雷伯氏菌后重新PCR擴(kuò)增出同源重組片段部分序列及變棲 克雷伯氏菌下游基因組序列的PCR檢測結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0013] 在介紹具體實(shí)施例前，首先對(duì)實(shí)施例中所用到的部分原料和試劑簡要介紹說明如 下，未說明內(nèi)容以現(xiàn)有技術(shù)中常用原料和試劑為準(zhǔn)。
[0014] 菌株與質(zhì)粒載體 本發(fā)明所構(gòu)建的普魯蘭酶工程菌以變棲克雷伯氏菌HN7 (Klebsiella variicola HN7)為基礎(chǔ)，該菌從淀粉生產(chǎn)廠附近土壤中篩選獲得，目前已于2015年1月14日保藏于中 國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(北京)，保藏編號(hào)為：CGMCC NO. 10357。
[0015] 枯草芽孢桿菌1. 4255,來自于中國普通微生物菌種保藏管理中心。
[0016] PBR322質(zhì)粒，購自于寶生物工程（大連）有限公司。
[0017] 微生物培養(yǎng)所用培養(yǎng)基 變棲克雷伯氏菌HN7 (Klebsiella variicola HN7)保藏米用斜面保藏方式，斜面 保藏培養(yǎng)基（w/v)配方如下：糯米粉1.0%，蛋白胨0.5%，酵母膏0.5%，KH2PO4 0.05%， MgSO4. 7H20 0· 01%，KH2PO4 0· 05%，瓊脂 2. 0%，pH 6. 0。
[0018] 變棲克雷伯氏菌HN7 (Klebsiella variicola HN7)及改造后菌株擴(kuò)增采用種 子培養(yǎng)基進(jìn)行擴(kuò)增，種子培養(yǎng)基（w/v)配方如下：蛋白胨1. 0%，牛肉膏0. 3%，NaCl 0. 5%，pH 6. 0〇
[0019] 所構(gòu)建的新的高產(chǎn)普魯蘭酶工程菌及對(duì)照菌株（即原始出發(fā)菌株）產(chǎn)酶采用產(chǎn) 酶培養(yǎng)基，產(chǎn)酶培養(yǎng)基（w/v)配方如下：糯米粉0. 5%，蛋白胨0. 5%，KH2PO4 0. 05%，MgSO4 ? 7H20 0· 01%，pH 自然。
[0020] 篩選菌株時(shí)采用LB培養(yǎng)基，LB培養(yǎng)基（w/v)配方如下：胰蛋白胨1%，酵母提取物 0. 5 %，NaCl 1 % (固體培養(yǎng)基含1.5%瓊脂粉)。
[0021] 部分試劑與酶 四環(huán)素、3, 5-二硝基水楊酸（DNS)、DNA凝膠回收試劑盒、Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA提 取試劑盒購自上海生工生物工程有限公司； 普魯蘭多糖為東京化成工業(yè)株式會(huì)社產(chǎn)品。