一種全層皮膚模型的構建方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于組織工程學醫(yī)用生物材料技術領域，具體涉及一種可替代皮膚進行化妝品、小分子化合物、活性蛋白、醫(yī)療器械、化學品、一次性衛(wèi)生用品等產品的安全性與功效檢測及其他與皮膚接觸的材料的安全性與功效性評價的全層皮膚模型的構建方法。
【背景技術】
[0002]皮膚模型是指利用工程學和細胞生物學的原理和方法，在體外人工制備的皮膚替代品。全層皮膚模型與正常皮膚結構高度類似，具有完整的表皮層和真皮層結構，除可用來修復、替代缺損的皮膚組織外，其最大的用途在于替代人體皮膚組織進行化妝品、小分子化合物、活性蛋白、醫(yī)療器械、化學品、一次性衛(wèi)生用品、與皮膚接觸材料的安全性與功效性評價。
[0003]真皮層的體外構建技術是全層皮膚模型開發(fā)的關鍵。目前，主要有兩種類型的技術:一種是應用材料學和生物工程學原理構建的真皮替代物，該類體外構建技術不利于細胞生長，難以實現替代真皮組織進行細胞功能的檢測與評價。另一類是應用細胞復合材料培養(yǎng)的方法，比如以膠原等天然材料為支架，復合成纖維細胞構建成真皮層，并于其上接種表皮細胞，進一步構建成全層皮膚結構(如專利CN101062429、CN103041453A)。但此法獲得的人工皮膚無法完全替代皮膚組織進行化妝品、小分子化合物、活性蛋白、醫(yī)療器械、化學品、皮膚接觸性材料等的測試評價要求。用支架材料和活細胞構建的皮膚模型在培養(yǎng)過程中伴隨著活細胞自身膠原的分泌以及支架材料的降解，導致人工皮膚組織收縮現象，嚴重影響全層皮膚模型體外構建中的傳質效率，造成邊緣收縮與培養(yǎng)器皿壁的分離，同時真表皮層之間不能形成與天然皮膚一致的基底膜結構，均對體外測試結果有影響。
[0004]目前尚未有不采用支架材料，僅依靠細胞自身分泌的細胞外基質構建形成的真皮層結構以及由真皮層支持生發(fā)的表皮結構結合形成的全層皮膚結構。

【發(fā)明內容】

[0005]針對現有技術存在的不足，本發(fā)明的目的是:構建一種全層皮膚模型，該皮膚模型不含外源支架材料，具有成纖維細胞及自分泌細胞外基質組成的真皮層和表皮細胞組成的表皮層，結構更接近人體皮膚結構，具有良好的力學性能、結構穩(wěn)定性和細胞應答敏感性等特點，可應用于多種皮膚替代測試。
[0006]本發(fā)明的全層皮膚模型的體外構建方法，包括以下步驟:
[0007]步驟一、成纖維細胞和表皮細胞的分離培養(yǎng)
[0008]成纖維細胞分離培養(yǎng):將已去除脂肪和結締組織的Imm3的皮膚組織，置于含有膠原酶200U.πιΓ1、透明質酸300U.πιΓ1的培養(yǎng)液I中，放置4°C過夜；再加入等體積的消化液，37°C空氣搖床180rpm 20min后終止消化；100rpm離心1min收集細胞；用培養(yǎng)液II調整細胞密度，每毫升2 X 15?4X 10 5個/cm 2細胞接種，5% CO 2、37°C條件下培養(yǎng)；
[0009]表皮細胞分離培養(yǎng):將表皮組織浸沒于1.2U/mL的消化液中，置入4°C條件下16?20h ;在無菌條件下撕下表皮層，將表皮層放入37°C預熱的消化液中，維持37°C消化1min后終止:每2min震蕩3下；無菌200目篩網過濾，800r/min離心6min后棄上清；加入37°C預熱的PBS緩沖液，吹打至均勻后，再次800r/min離心6min后，棄上清:加入培養(yǎng)液I，吹打至均勻；按照3 X 14?5X10 4個/cm2的密度接種，移入5% CO 2、37°C條件下培養(yǎng)，取第3?7代細胞用于構建。
[0010]其中培養(yǎng)液I為DMEM (sigma公司生產)，含有谷氨酰胺2?10mM、孕酮10?20nM、丁二胺30?60 μΜ、砸酸鈉15?30ηΜ、轉鐵蛋白65?100ng/ml ;培養(yǎng)液II為10%胎牛血清(FBS)+90% DMEM ;消化液為含有0.25%胰酶和0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)的磷酸鹽緩沖液(PBS) ο
[0011]步驟二、真皮層構建
[0012]取第5?10代成纖維細胞，按照每毫升培養(yǎng)液III含0.5 X 16?3 X 10 6個成纖維細胞進行接種，置于5% C02、37°C條件下培養(yǎng)2?3小時，加入培養(yǎng)液IV培養(yǎng)；每隔22?26小時更換培養(yǎng)液IV—次，共培養(yǎng)12?14天。
[0013]其中培養(yǎng)液III是在DMEM培養(yǎng)液中添加體積比9:1的FBS，添加50?100mg/L的維生素 c (Vc);培養(yǎng)液IV為 75 % DMEM+25 % DMEM/F12 (體積比為 3:1)，添加 NaHCO3S 3 ?5mg/ml，孕酮30?50nM，丁二胺30?60 μ Μ，砸酸鈉10?20ηΜ，50?100mg/L的維生素C，胰島素15?30ng/ml，胎牛血清3?10%，氫化可的松150?180ng/L，腺嘌呤55?75 μ g/ml，堿性成纖維細胞生長因子8?12ng/ml，轉鐵蛋白10?20ng/ml，血管生長因子5?1ng/ml ο
[0014]步驟三、表皮層構建
[0015]將培養(yǎng)液IV吸棄，將準備好的第3?7代表皮細胞按0.1 X 15?1.5 X 10 5個/cm2接種于真皮層表面，加入培養(yǎng)液V -SKl培養(yǎng)；置于5% C02、37°C條件下培養(yǎng)，每隔22?26小時換液一次，共培養(yǎng)48小時，得到雙層皮膚。其中，培養(yǎng)液V -SKl:培養(yǎng)液IV +表皮生長因子(0.6?2ng/ml) +角質細胞生長因子(KGF) (0.5?5ng/ml) +粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF) (2.5 ?10ng/ml)；
[0016]步驟四、全層皮膚的培養(yǎng)
[0017]將制備的雙層皮膚取出，放在培養(yǎng)支架表面，加入培養(yǎng)液V -SKl進行氣液面培養(yǎng)；培養(yǎng)48h后更換為培養(yǎng)液V -SK2，進行氣液面培養(yǎng)；培養(yǎng)48h后更換為培養(yǎng)液V -SK3，液面與皮膚表面平齊；培養(yǎng)48h后更換為培養(yǎng)液V -SK4，液面與培養(yǎng)支架平齊，繼續(xù)培養(yǎng)至結束，得到全層皮膚。
[0018]步驟四中的培養(yǎng)條件均為37°C，5% CO2環(huán)境。
[0019]其中，培養(yǎng)液V -SK2:培養(yǎng)液IV +氯化鈣(15?30 μ g/ml)+維生素C(50?100 μ g/ml)+表皮細胞生長因子(20?25ng/ml);培養(yǎng)液V-SK3:培養(yǎng)液IV +氯化鈣(150?200 μ g/ml)+維生素C(50?100 μ g/ml) +表皮細胞生長因子(20?30ng/ml);培養(yǎng)液V -SK4:培養(yǎng)液IV +氯化鈣(I?20mg/ml) +表皮細胞生長因子(10?35ng/ml)。
[0020]本發(fā)明所構建的模型，是通過維生素C誘導成纖維細胞快速增殖并大量分泌胞外基質，胞外基質與細胞均勻分布和排列形成的多層細胞膜片，其厚度達到200?300 ym ;膜片形成后在膜片上進行表皮細胞接種，接種后進行復層化培養(yǎng)，待表皮復層化且厚度達到150?200 μ m后，全層皮膚模型構建成功。
[0021]本發(fā)明對全層皮膚模型進行了構建工藝上的創(chuàng)新，無需添加外源支架材料，通過真皮層發(fā)育和三維培養(yǎng)體系的建立，促使真皮層的細胞大量分泌膠原并形成成熟的胞外基質，在細胞復層化的過程中胞外基質又為細胞提供了天然的三維支架和生長空間，最大程度保留和提高了真皮層細胞分泌的活性因子，構建了接近天然皮膚的細胞微環(huán)境及皮膚結構；同時，通過多次接種與細胞增殖自身的復層化過程相結合，增加了真皮層的厚度、機械強度、穩(wěn)定性；此外，在真皮層的構建過程中避免了外源材料的添加；真皮層與表皮結合后，培養(yǎng)液能夠滿足真皮層和表皮層細胞的活性及生物學功能的發(fā)揮，避免真皮層不生長和降解的發(fā)生，同時真表皮連接緊密并形成良好的基底膜結構。如此完整的皮膚模型，可用于替代動物、人體皮膚組織開展活性物質的安全性與功效性檢測。
[0022]與現有技術相比，本發(fā)明所使用的細胞培養(yǎng)膜片技術能促進細胞形成較好的胞外基質和促進細胞三維生長的支架結構，以保證細胞的活力和生物學功能。較現有采用膠原做支架材料復合成纖維細胞構建真皮的方法，避免了成纖維細胞在構建過程中降解外源膠原和自分泌膠原進行重新組裝的過程。本發(fā)明最大程度地重現了細胞在體內參與組織形成的過程。避免膠原降解過程中出現的支架收縮而導致的表皮層與真皮層結合不緊密，出現氣液面控制不準確、表皮層細胞過度角質化等問題。
[0023]與現有產品相比，本發(fā)明所制備的全層皮膚具有以下優(yōu)點:
[0024](I)具有較好的真表皮結構，成纖維細胞分泌膠原并復層化替代以支架材料為載體的真皮層，厚度及細胞分布密度與天然皮膚接近；
[0025](2)與在外源支架材料基礎上構建的皮膚模型相比，其胞外基質主要由真皮細胞自分泌形成，避免了在測試過程中因外源支架材料的存在而影響測試結果；
[0026](3)多批次的實驗證明，本發(fā)明所用的細胞膜片技術制備的真皮層，其厚度、細胞數量以及組織活力可以做到穩(wěn)定控制；
[0027](4)真皮層細胞具有較好的由自身分泌胞外基質形成的微環(huán)境，有利于細胞活性與功能的保持；
[0028](5)真皮層與表皮層結合緊密，真表皮結構與天然皮膚結構一致；
[0029](6)無外源材料支架的真皮層含有更多成纖維細胞分泌的因子與保外基質，能更好的促進和支持表皮增殖與分化；
[0030](7)不收縮，與小室形成密閉的實體；
[0031](8)應用范圍廣，可用于化妝品、小分子化合物、活性蛋白、醫(yī)療器械、化學品、一次性衛(wèi)生用品、與皮膚接觸材料的安全性與功效性評價。
[0032]下面結合附圖和實施例對本發(fā)明做進一步說明。
【附圖說明】
[0033]圖1為全層皮膚的組織學切片照片。其中b是表皮層，a是真皮層。
[0034]圖2為全層皮膚進行化妝品原料有效性測試應用過程照片
[0035]其中，圖2-1為全層皮膚進行化妝品原料有效性測試樣品孵育照片；
[0036]圖2-2為全層皮膚進行化妝品原料有效性測試樣品孵育后皮片清洗照片；
[0037]圖2-3為全層皮膚進行化妝品原料有效性測試樣品孵育后活性指示劑溶出示意圖。
【具體實施方式】
[0038]實施例1.一種全層皮膚模型的構建方法，包括以下步驟:
[0039]步驟一、成纖維細胞和表皮細胞的分離培養(yǎng):成纖維細胞分離培養(yǎng)，將已去除脂肪和結締組織的包皮組織切成Imm3的皮膚組織置于含有膠原酶200U.ml '透明質酸300U.ml—1的培養(yǎng)基I中，放置4°C過夜，再加入等體積的消化液，37°C空氣搖床180rpm20min后終止消化；100rpm離心1min收集細胞；用含有培養(yǎng)液II調整細胞密度2 X 15個/cm2細胞接種，5.0% CO 2、37°C條件下培養(yǎng)；
[0040]表皮細胞分離培養(yǎng)，將表皮層組織浸沒于1.2U/mL的消化液中，置入4°C條件下20h;在無菌條件下撕下表皮層，將表皮層放入37°C預熱的消化液中，在37°C條件下，消化1min后終止，每2min震蕩3下；無菌200目篩網過濾，800r/min離心6min后棄上清；加入37°C預熱的PBS緩沖液，吹打至均勻后再次800r/min離心6min后棄上清，加入培養(yǎng)液I，吹打至均勻；按照3X 1Vcm2的密度接種，移入5% C02、37°C條件下培養(yǎng)，取第3代細胞用于構建。
[0041]其中培養(yǎng)液I為DMEM，含有谷氨酰胺5mM、孕酮ΙΟηΜ、丁二胺35 μ M、砸酸鈉15ηΜ、轉鐵蛋白65ng/ml (sigma);培養(yǎng)液II為10% FBS+90% DMEM ;消化液為含有0.25%胰酶和0.02% EDTA 的 PBS0
[0042]步驟二、真皮層構建:取P7代的成纖維細胞，每Iml培養(yǎng)液III含1.1 X 16個成纖維細胞，取0.2mL接種于0.5cm2的trans-well小室；放入含5% CO 2、37°C孵箱中培養(yǎng)3小時，加入培養(yǎng)液IV ;每隔22小時更換培養(yǎng)液IV—次，共培養(yǎng)12天。
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