提供流感病毒異源保護的病毒樣顆粒及其方法和應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程領域，微生物領域及生物制藥領域，特別涉及一種提供流感 病毒異源保護的病毒樣顆粒及其方法和應用。
【背景技術】
[0002] A型流感病毒病毒感染能夠引起呼吸道疾病對人類健康和世界經(jīng)濟造成嚴重影 響，1997年第一次報道人感染高致病性H5N1 (HPAI)流感病毒感染，據(jù)世界衛(wèi)生組織報道截 止到2014年1月9號全球共報道649人感染病例，并引起385人死亡，從2003年開始高致 病性H5N1成為主要的人獸共患病之一并且不斷的衍生出新的譜系，高致病H5N1主要在中 國，越南，印度尼西亞，埃及，哥倫比亞和孟加拉國等地流行，其中2. 3. 2. 1和2. 3. 4譜系成 為主要的流行譜系，但是現(xiàn)在也很難預測不同的H5N1譜系中哪個會造成大規(guī)模的流行，因 此現(xiàn)在急需發(fā)明一種疫苗能夠交叉保護不同H5N1譜系的病毒。
[0003] 現(xiàn)在主要通過雞胚進行流感疫苗的大量生產(chǎn)，但是在流感大流行季節(jié)這種生產(chǎn)方 式很難滿足流感疫苗的大量生產(chǎn)，并且常常需要花費數(shù)月的時間來確定新的流感流行譜 系，更重要的是最近在亞洲流行的H5N1流感病毒能夠造出雞胚的死亡。然而基于重組桿狀 病毒生產(chǎn)的流感病毒樣顆粒能夠解決H5N1流感疫苗生產(chǎn)中的問題，因此病毒樣顆粒成為 一種無生物安全風險，低成本，和高產(chǎn)出的流感疫苗生產(chǎn)方式。流感病毒樣顆粒具有和天 然病毒相似的HA結構，因為其HA結構避免了常規(guī)滅活疫苗生產(chǎn)中的化學物質的破壞，從而 能夠產(chǎn)生更好的免疫保護作用。
[0004] 目前流感病毒樣顆粒包括由流感HA、NA和流感基質蛋白Ml或者HA和Ml在小鼠 實驗中能夠產(chǎn)生真對流感高滴度的特異性抗體，這些顆粒能夠展示出很好的針對異源流感 病毒的保護活性，但是還沒有文獻報道與滅活的全病毒疫苗相比流感病毒真對不同H5N1 譜系的保護活性。

【發(fā)明內容】

[0005] 為解決上述現(xiàn)有技術存在的問題，本發(fā)明的目的在于提供一種提供流感病毒異 源保護的病毒樣顆粒及其方法和應用。本發(fā)明利用昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)生產(chǎn)包含流感 NA-HA-Ml的H5N1流感病毒樣顆粒，并且在小鼠體內研宄在弗式佐劑時與滅活的流感疫苗 相比針對不同譜系的流感的病毒的保護活性。
[0006] 為達到上述目的，本發(fā)明的技術方案為：
[0007] -種提供流感病毒異源保護的病毒樣顆粒，由依據(jù)昆蟲細胞偏愛密碼子優(yōu)化后的 H5N1流感NA-HA-Ml基因與經(jīng)酶切的pFastBac 1載體連接，制得重組桿狀病毒Bacmid質粒， 并轉染昆蟲細胞得到重組桿狀病毒，用該病毒接種昆蟲細胞后，表達得到所述病毒樣顆粒， 其中，優(yōu)化后的H5N1流感NA-HA-Ml基因序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0008] 進一步的，所述優(yōu)化后的H5N1流感NA-HA-Ml基因與pFastBacl載體酶切的限制 性內切酶為Not I和Sph I。
[0009] 進一步的，所述優(yōu)化遵循：編碼的氨基酸序列不變；將稀有密碼子去除；將影響 mRNA穩(wěn)定性和核糖體結合的莖環(huán)結構破壞。
[0010] 進一步的，所述病毒樣顆粒的純化方式為，在4 °C離心機中用2, OOOrpm離心 20min去掉細胞碎片，用30, OOOrpm離心60分鐘進行濃縮，用PBS溶解沉淀過夜后經(jīng) 20% -30% -60%的蔗糖30, OOOrpm離心1小時進行純化。
[0011] 上述提供流感病毒異源保護的病毒樣顆粒的制備方法，包括如下步驟：
[0012] 步驟一、重組桿狀病毒Bacmid質粒的構建：將優(yōu)化的NA-HA-Ml基因和pFastBacl 載體的基因進行多克隆位點分析，選擇載體上提供而目的片段中沒有的兩個限制性內切 酶：Not I和Sph I，雙酶切后回收目的片段插入到昆蟲細胞表達載體pFastBacl中，轉化大 腸桿菌DHlOBac感受態(tài)細胞；
[0013] 步驟二、重組桿狀病毒的拯救：用重組桿狀病毒Bacmid質粒轉染昆蟲細胞，拯救 獲得重組桿狀病毒；
[0014] 步驟三、高致病性H5N1流感病毒樣顆粒的制備：將獲得的重組桿狀病毒按MOI = 3接種昆蟲細胞，3天后收獲上清，即得高致病性H5N1流感病毒樣顆粒。
[0015] 進一步的，所述步驟一中，具體操作為：：取1 μ IpFastBac-NA-HA-Ml加入到50 μ 1 感受態(tài)DHlOBac細胞中，冰浴30min，42°C熱激45s，冰浴2min，加入1ml無抗性的LB培養(yǎng) 基，37°C培養(yǎng)48h，挑取白斑菌落，加入LB培養(yǎng)基，37°C 200rpm/min搖床培養(yǎng)12h，提取質 粒DNA進行PCR鑒定，鑒定正確的陽性質粒即為重組桿狀病毒Bacmid質粒。
[0016] 進一步的，所述步驟二、三中使用的昆蟲細胞為Sf9細胞。
[0017] 進一步的，所述步驟二中待Sf9細胞的細胞匯合達到80%以上時方進行轉染。
[0018] 上述提供流感病毒異源保護的病毒樣顆粒在制備特異性疫苗預防流感方面的應 用。
[0019] 上述提供流感病毒異源保護的病毒樣顆粒在保護同源2. 3. 2. 1病毒和異源2. 3. 4 病毒的攻擊方面的應用。
[0020] 相對于現(xiàn)有技術，本發(fā)明的有益效果為：本發(fā)明利用桿狀病毒/昆蟲細胞表達系 統(tǒng)來生產(chǎn)高致病性H5N1流感病毒病毒樣顆粒在流感大流行季節(jié)這種生產(chǎn)方式能夠滿足流 感疫苗的大量生產(chǎn)的優(yōu)勢，具有產(chǎn)量高，生產(chǎn)陳本低，免疫原性好，無生物安全風險等優(yōu)點。 本發(fā)明的流感病毒病毒樣顆粒，以桿狀病毒作為表達載體，以Sf9細胞作為生物反應器，制 備的高致病性H5N1流感病毒病毒樣顆粒具有產(chǎn)量高，生產(chǎn)陳本低，免疫原性好，便于大規(guī) 模生產(chǎn)等優(yōu)點，且小鼠實驗證明對同源2. 3. 2. 1和異源2. 3. 4病毒具有良好的免疫和預防 效果。
【附圖說明】
[0021] 圖1㈧為本發(fā)明實施施例1中重組桿狀病毒NA-HA-Ml的基因構建示意圖，PolH 為pFastBacl的Y端多角體啟動子，p(A)為pFastBacl3<端轉錄終止信號。（B)和（C) 為重組桿狀病毒感染SF9細胞后間接免疫熒光結果（B)為重組桿狀病毒rBV-NA-HA-Ml感 染組，（C)為正常細胞組，（D)為重組桿狀病毒感染細胞上清的電鏡觀察結果，標尺代表1OOnm0
[0022] 圖2為重組桿狀病毒感染上清的血凝抑制結果和純化后H5N1病毒樣顆粒的 SDS-PAGE蛋白電泳和WB結果：(A)重組桿狀病毒感染上清以0. 85 %雞紅細胞血凝實驗表 明可以產(chǎn)生27的血凝效價，正常細胞上清（Mock)組沒有觀察到血凝現(xiàn)象。（B)以純化的 H5N1病毒樣顆粒10, 2. 5和0. 6 μ g總蛋白進行SDS-PAGE電泳和考馬斯亮藍染色后結果， (C) WB鑒定結果，可以看到相應的HA，NA和Ml的分子量70, 52and 25kDa，M :標準分子量蛋 白。
[0023] 圖3為小鼠體液免疫和中和抗體產(chǎn)生情況。（A) (B)分別為在免疫0, 3, 5周后針 對 A/meerkat/Shanghai/SH-1/2012 (A)和 A/duck/Jilin/JL-SIV/2013 (B)血凝抑制抗體產(chǎn) 生情況，（C) (D)分別為在免疫 0, 3, 5 周后針對 AA/meerkat/Shanghai/SH-1/2012 (C)和 A/ duck/Jilin/JL_SIV/2013(D)IgG 特異性抗體產(chǎn)生情況，（E)為針對 A/meerkat/Shanghai/ SH-l/2012IgGl和IgG2a抗體亞型的分類，（F)為免疫后5周針對SH-I和JL-SIV的血清中 和抗體產(chǎn)生。數(shù)據(jù)表示平均值土SD(每組5只），*P〈0. 05, **P〈0. 01與滅活疫苗組相比。
[0024] 圖 4 為針對同源 A/meerkat/Shanghai/SH-1/2012 (clade2. 3. 2. 1)和異源 A/duck/ Jilin/JL-SIV/2013(clade2. 3.4)小鼠攻毒保護實驗結果。每組5只小鼠。（A)和（B)分 別為同源A/meerkat/Shanghai/SH-1/2012 (clade2. 3. 2. 1)攻毒后小鼠體重變化（A)和生 存率變化（B)。（C)和（D)分別為異源A/duck/Jilin/JL-SIV/2013 (2. 3. 4譜系）攻毒后小 鼠體重變化（C)和生存率變化（D)。
[0025] 圖5為攻毒后4天小鼠脾淋巴細胞細胞因子分泌情況。細胞因子IFN-γ (A) and IL-4 (B)在攻毒后4天分離脾淋巴細胞，用純化后的滅活病毒A/meerkat/Shanghai/ SH-1/2012刺激脾淋巴細胞，單獨細胞組（Cell alone)，滅活病毒刺激組（inactive SH-1)，分泌細胞因子數(shù)代表每IO6脾淋巴細胞的細胞因子分泌情況。數(shù)據(jù)表示平均值 土SD(每組3只），#P〈0. 01與滅活疫苗組相比·
[0026] 圖6為攻毒后4天肺病毒滴度。在免疫后4天取小鼠肺組織，進行感染雞胚滴定其 在雞胚中的半數(shù)感染量EID 5tZml。數(shù)據(jù)表示平均值土SD(每組3只），林Ρ〈0· 01，林*P〈0. 001 與滅活疫苗組相比.
【具體實施方式】
[0027] 下面結合附圖及【具體實施方式】對本發(fā)明技術方案做進一步詳細描述：若未特別指 明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規(guī)手段，所用原料均為市售商 品。
[0028] 實施例1Η5Ν1流感病毒樣顆粒的制備及鑒定
[0029] 1 材料
[0030] 供體質粒 pFastBacl，菌種 Ε. coli DHlOBac,昆蟲細胞 Sf9,購自 Invitrogen 公 司。IPTG，X-gal夠自大連寶生物公司，T4DNA連接酶，凝膠回收試劑盒，質粒提取試劑盒購 自Axygen公司，脂質體Lipofection2000購自Invitrogen公司，氨節(jié)青霉素，四環(huán)霉素，卡 納霉素，慶大霉素購自Sigma公司，胎牛血清為長春西諾生物科技有限公司生產(chǎn)，TMN昆蟲 細胞培養(yǎng)基購自Applichem公司，H5雞陽性血清為本實驗