一對特異識別綿羊il8基因的多肽及其編碼基因和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及一對特異識別綿羊IL8基因的多肽及其編碼 基因和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 白細(xì)胞介素-8是趨化因子家族的一種細(xì)胞因子，在參與和調(diào)節(jié)生殖生理和病理 過程的作用已得到肯定，其作用機制之一就是與其特異性受體結(jié)合而發(fā)揮作用。
[0003] IL-8主要由單核-巨噬細(xì)胞產(chǎn)生；其他如成纖維細(xì)胞、上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、肝細(xì) 胞等亦可在適宜的刺激條件下產(chǎn)生IL-8。IL-8的分子量約8KD，主要活性形式為72個氨 基酸。IL-8的氨基酸順序與許多炎癥因子有較高的同源性，屬于同一個家族；現(xiàn)初步證實 IL-8家族（亦稱pf4家族）至少有12個成員。IL-8可以分成α和β亞群，IL-8的受體 也有兩型：一種只能與IL-8結(jié)合，而另一種還能結(jié)合其它的趨化因子；中性粒細(xì)胞和嗜堿 性粒細(xì)胞表面均表達(dá)豐富的IL-8受體。
[0004] IL-8的主要生物學(xué)活性是吸引和激活中性粒細(xì)胞，曾被命名為中性粒細(xì)胞激活肽 (NAF)、粒細(xì)胞趨化肽（GCP)、中性粒細(xì)胞激活因子（NAF)等。中性粒細(xì)胞與IL-8接觸后發(fā) 生形態(tài)變化，定向游走到反應(yīng)部位并釋放一系列活性產(chǎn)物；這些作用可導(dǎo)致機體局部的炎 癥反應(yīng)，達(dá)到殺菌和細(xì)胞損傷的目的。此外IL-8對嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞和淋巴細(xì) 胞也有一定作用。
[0005] 基因表達(dá)譜芯片研宄結(jié)果顯示，敖漢細(xì)毛羊被毛豐富的體側(cè)部皮膚IL8基因的表 達(dá)量相對于腹股溝部（無被毛）上調(diào)7. 24倍（Zhao et al·，2012)。由此可見，IL8基因可 作為綿羊抗病育種及羊毛經(jīng)濟性狀育種的一個重要候選基因。在細(xì)胞或個體水平上對綿羊 IL8基因進行敲除或修飾，可解析綿羊IL8基因的功能，為綿羊育種及醫(yī)藥研發(fā)服務(wù)。
[0006] 轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子核酸酶（transcription activator-like effector nucleases，TALENs)技術(shù)是一個高效的基因打靶新工具。轉(zhuǎn)錄因子激活效應(yīng)物家族中有一 種蛋白（TALEs)能夠識別、結(jié)合DNA。TALE與DNA序列特異性結(jié)合主要是由TAL結(jié)構(gòu)內(nèi)34 個恒定氨基酸序列介導(dǎo)。將TALEs與Fokl核酸內(nèi)切酶的切割域相連接，形成TALENs，從而 可以實現(xiàn)對基因組DNA序列的精確修飾。TALENs是一種異源二聚體分子（兩單位的TALE DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合到一單位的催化性結(jié)構(gòu)域），能夠切割兩個相隔較近的序列，從而使得 特異性增強。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是提供一對特異識別綿羊IL8基因的多肽及其編碼基因和應(yīng)用。本 發(fā)明利用這對多肽構(gòu)建獲得的一對重組的轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子（TALE)能夠特異性地識 別綿羊IL8基因。本發(fā)明還利用這對轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子構(gòu)建獲得的一對轉(zhuǎn)錄激活子樣 效應(yīng)因子核酸酶（TALENs)，能夠?qū)d羊IL8基因進行準(zhǔn)確、高效地靶向修飾。
[0008] 具體地，本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的：
[0009] -對特異識別綿羊IL8基因的多肽（命名為特異多肽對），由多肽甲和多肽乙組 成；所述多肽甲由14個TAL核酸識別單元組成，每個TAL核酸識別單元中具有兩個雙連氨 基酸；所述多肽乙由16個TAL核酸識別單元組成，每個TAL核酸識別單元中具有兩個雙連 氨基酸；
[0010] 所述多肽甲中的14個雙連氨基酸依次如下：序列表的序列2自N末端第12-13位 氨基酸殘基、第46-47位氨基酸殘基、第80-81位氨基酸殘基、第114-115位氨基酸殘基、第 148-149位氨基酸殘基、第182-183位氨基酸殘基、第216-217位氨基酸殘基、第250-251位 氨基酸殘基、第284-285位氨基酸殘基、第318-319位氨基酸殘基、第352-353位氨基酸殘 基、第386-387位氨基酸殘基、第420-421位氨基酸殘基和第454-455位氨基酸殘基。
[0011] 所述多肽乙中的16個雙連氨基酸依次如下：序列表的序列4自N末端第12-13位 氨基酸殘基、第46-47位氨基酸殘基、第80-81位氨基酸殘基、第114-115位氨基酸殘基、第 148-149位氨基酸殘基、第182-183位氨基酸殘基、第216-217位氨基酸殘基、第250-251 位氨基酸殘基、第284-285位氨基酸殘基、第318-319位氨基酸殘基、第352-353位氨基酸 殘基、第386-387位氨基酸殘基、第420-421位氨基酸殘基、第454-455位氨基酸殘基、第 488-489位氨基酸殘基和第522-523位氨基酸殘基。
[0012] 所述多肽甲具體可如序列表的序列2所示。
[0013] 所述多肽乙具體可如序列表的序列4所示。
[0014] 本發(fā)明還保護一對DNA分子（命名為特異DNA分子對），由編碼所述多肽甲的DNA 分子甲和編碼所述多肽乙的DNA分子乙組成。
[0015] 所述DNA分子甲中，編碼所述多肽甲的14個雙連氨基酸的核苷酸依次如下：序列 表的序列1自5'末端第34-39位核苷酸、第136-141位核苷酸、第238-243位核苷酸、第 340-345位核苷酸、第442-447位核苷酸、第544-549位核苷酸、第646-651位核苷酸、第 748-753位核苷酸、第850-855位核苷酸、第952-957位核苷酸、第1054-1059位核苷酸、第 1156-1161位核苷酸、第1258-1263位核苷酸和第1360-1365位核苷酸。
[0016] 所述DNA分子乙中，編碼所述多肽乙的16個雙連氨基酸的核苷酸依次如下：序列 表的序列3自5'末端第34-39位核苷酸、第136-141位核苷酸、第238-243位核苷酸、第 340-345位核苷酸、第442-447位核苷酸、第544-549位核苷酸、第646-651位核苷酸、第 748-753位核苷酸、第850-855位核苷酸、第952-957位核苷酸、第1054-1059位核苷酸、第 1156-1161位核苷酸、第1258-1263位核苷酸、第1360-1365位核苷酸、第1462-1467位核苷 酸和第1564-1569位核苷酸。
[0017] 所述DNA分子甲具體可如序列表的序列1所示。
[0018] 所述DNA分子乙具體可如序列表的序列3所示。
[0019] 本發(fā)明還保護所述特異多肽對在特異識別和靶向修飾綿羊IL8基因中的應(yīng)用。所 述綿羊IL8基因，其NCBI登錄號為NM_001009401。
[0020] 本發(fā)明還保護所述特異多肽對在構(gòu)建綿羊IL8基因突變庫中的應(yīng)用。所述綿羊 IL8基因，其NCBI登錄號為NM_001009401。
[0021] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供了特異識別綿羊IL8基因的多肽對，并提供了該多 肽對的編碼基因。本發(fā)明可實現(xiàn)在細(xì)胞或個體水平上對綿羊IL8基因進行敲除或修飾，以 解析綿羊IL8基因的功能、構(gòu)建綿羊IL8基因突變庫或獲得相關(guān)疾病模型，為綿羊育種及醫(yī) 藥研發(fā)服務(wù)。
【附圖說明】
[0022] 圖1為TALENs靶點設(shè)計結(jié)果示意圖。
[0023] 圖2為TALEN質(zhì)粒對（左臂TALEN和右臂TALEN)轉(zhuǎn)染綿羊SEF細(xì)胞48小時后提 取DNA進行PCR擴增，將PCR產(chǎn)物克隆后的部分測序結(jié)果（突