與辣椒根腐疫病特異抗性基因緊密連鎖的分子標(biāo)記及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及分子標(biāo)記，特別是涉及2個(gè)與辣椒根腐疫病特異抗性基因緊密連鎖的分子標(biāo)記及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]辣椒疫病是由辣椒疫霉菌Mora capsici Leon.)引起的一種毀滅性土傳病害(Leonian，1922)，在世界范圍內(nèi)廣泛傳播。廣東地區(qū)由于高溫高濕氣候條件的影響，辣椒疫病尤為嚴(yán)重，辣椒生產(chǎn)經(jīng)常損失慘重。
[0003]辣椒疫病根據(jù)病原菌侵染部位的不同表現(xiàn)為根腐、果腐、莖枯和葉枯等不同病癥(Ristaino, 1990)，并且多項(xiàng)研宄結(jié)果認(rèn)為，根腐、果腐、莖枯和葉枯疫病抗性的遺傳機(jī)理并不相同(Barksdale et al., 1984; Sy et al., 2005)。辣椒根腐疫病的發(fā)生通常直接導(dǎo)致植株不可逆死亡，對(duì)辣椒生產(chǎn)的損害最為嚴(yán)重，國(guó)內(nèi)外學(xué)者研宄結(jié)果表明根腐疫病的抗性遺傳機(jī)制從廣義上可分為2種類型，分別為數(shù)量抗性和特異抗性。數(shù)量抗性表現(xiàn)為多基因控制，目前多項(xiàng)研宄結(jié)果鑒定并定位的主效根腐疫病抗性基因位于辣椒第5號(hào)染色體上(Quirin et al., 2005; Truong et al., 2013);特異抗性為單基因控制，表現(xiàn)為對(duì)某種特異菌株具有完全抗性(Monroy-Barbosa and Bosland, 2008)，目前為止，國(guó)內(nèi)外還未見(jiàn)根腐疫病特異抗性基因定位的報(bào)道。
[0004]CM334是國(guó)際公認(rèn)的抗性水平最高的抗辣椒疫病材料，已在辣椒抗病研宄和育種中廣泛應(yīng)用。對(duì)基因(QTL)的鑒定及定位是利用分子標(biāo)記輔助選擇育種的前提。目前，只有辣椒第5號(hào)染色體上的主效抗性QTL位點(diǎn)緊密連鎖標(biāo)記開(kāi)發(fā)比較成熟，并能應(yīng)用于育種實(shí)踐中。由于辣椒疫病病癥表現(xiàn)多樣，辣椒疫霉菌又存在生理小種分化，要培育一個(gè)對(duì)所有疫霉菌都具有抗性的辣椒品種幾乎不可能，而考慮到其特異抗性的特點(diǎn)，針對(duì)當(dāng)?shù)貎?yōu)勢(shì)疫霉菌株鑒定抗性基因位點(diǎn)并開(kāi)發(fā)緊密連鎖分子標(biāo)記，有助于加快抗性品種的選育進(jìn)程。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供2個(gè)與辣椒根腐疫病特異抗性基因緊密連鎖的分子不己O
[0006]本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供用于擴(kuò)增與辣椒根腐疫病特異抗性基因緊密連鎖的分子標(biāo)記的引物對(duì)。
[0007]本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供所述與辣椒根腐疫病特異抗性基因緊密連鎖的分子標(biāo)記的應(yīng)用。
[0008]本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是:
與辣椒根腐疫病特異抗性基因緊密連鎖的分子標(biāo)記，定位于辣椒第10號(hào)染色體上，分別位于辣椒根腐疫病特異抗性基因兩側(cè)，命名為P52-11-21和P52-11-41。
[0009]所述分子標(biāo)記P52-11-21包含SEQ ID N0.1所示核苷酸序列；所述分子標(biāo)記P52-11-41包含SEQ ID N0.2所示核苷酸序列。
[0010]用于擴(kuò)增上述與辣椒根腐疫病特異抗性基因緊密連鎖的分子標(biāo)記的引物對(duì)。
[0011]用于擴(kuò)增分子標(biāo)記P52-11-21的引物序列如下所示:
Fl:5’ -CAATCCAAACAAGTCCTAAG-3，(SEQ ID N0.3)；
Rl:5’ -GGTGCAATTGAAAATCTAAG-3? (SEQ ID N0.4)；
用于擴(kuò)增分子標(biāo)記P52-11-41的引物序列如下所示:
F2:5’ -TTGATGAGATGGGAAGTAAA-3，(SEQ ID N0.5)；
R2:5’ -CACCAACAATAATAGAACTACA-3’ (SEQ ID N0.6)。
[0012]分子標(biāo)記P52-11-21和P52_ll_41在辣椒抗根腐疫病分子標(biāo)記輔助育種或者辣椒根腐疫病特異抗性基因定位中的應(yīng)用。
[0013]一種辣椒抗根腐疫病分子標(biāo)記輔助育種的方法，該方法包括:以CM334或其衍生品種為對(duì)象，用特異性引物PCR擴(kuò)增待檢測(cè)植株DNA，如果擴(kuò)增產(chǎn)物中存在所述分子標(biāo)記P52-11-21和/或分子標(biāo)記P52-11-41，則表示該植株中存在辣椒根腐疫病特異抗性基因。
[0014]本發(fā)明的有益效果是:
本發(fā)明提供了與辣椒根腐疫病特異抗性基因緊密連鎖的分子標(biāo)記P52-11-21與P52-11-41，所述分子標(biāo)記與根腐疫病特異抗性基因緊密連鎖，遺傳距離分別為1.5cM和1.lcM，可直接用于辣椒抗根腐疫病分子標(biāo)記輔助育種體系的建立。本發(fā)明的分子標(biāo)記及分子標(biāo)記擴(kuò)增引物可以簡(jiǎn)便、快速、高通量地應(yīng)用于辣椒育種實(shí)踐中，同時(shí)為克隆辣椒根腐疫病特異抗性基因及其功能研宄奠定了良好的基礎(chǔ)。
【附圖說(shuō)明】
[0015]1、圖1為抗性基因關(guān)聯(lián)區(qū)域:橫坐標(biāo)表示染色體位置，縱坐標(biāo)表示Δ (SNPjndex)的值；紅線表示所有Δ (SNPjndex)擬合后的結(jié)果；藍(lán)色虛線標(biāo)記Δ (SNPjndex)的閾值，擬合后的△ (SNP_index)越強(qiáng)，表不關(guān)聯(lián)性越強(qiáng)；
2、圖2為標(biāo)記P52-11-21的PCR擴(kuò)增結(jié)果七、匕分別為抗病親本CM334和感病親本10399的擴(kuò)增帶型，主帶分別為長(zhǎng)127bp和139bp B s分別為抗病混池和感病混池的擴(kuò)增帶型AC1F1群體隨機(jī)擴(kuò)增表示在BC ^群體中隨機(jī)挑選的10株抗病或感病單株的PCR擴(kuò)增結(jié)果，擴(kuò)增出長(zhǎng)139bp主帶的為感病單株，同時(shí)擴(kuò)增出127bp和139bp主帶的為雜合抗病單株；
3、圖3為標(biāo)記P52-11-41的PCR擴(kuò)增結(jié)果七、匕分別為抗病親本CM334和感病親本10399的擴(kuò)增帶型，主帶分別為長(zhǎng)147bp和141bp B s分別為抗病混池和感病混池的擴(kuò)增帶型AC1F1群體隨機(jī)擴(kuò)增表示在BC ^群體中隨機(jī)挑選的10株抗病或感病單株的PCR擴(kuò)增結(jié)果，擴(kuò)增出長(zhǎng)141bp主帶的為感病單株，同時(shí)擴(kuò)增出147bp和141bp主帶的為雜合抗病單株；
4、圖4為抗性基因的遺傳連鎖圖譜:左邊數(shù)值代表遺傳距離(單位:cM)，右邊標(biāo)示SSR分子標(biāo)記，均位于辣椒第10號(hào)染色體，根腐疫病抗性基因定位于標(biāo)記P52-11-21和P52-11-41 之間。
【具體實(shí)施方式】
[0016]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明，但并不局限于此。
[0017]以下實(shí)施例中所采用的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)包括DNA提取、PCR擴(kuò)增、PAGE凝膠電泳、酶切、轉(zhuǎn)化等實(shí)驗(yàn)，如無(wú)特殊說(shuō)明，通常按照常規(guī)方法操作，具體可參見(jiàn)《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(第三版)(Sambrook J, Russell Dff, Janssen K, Argentine J.黃培堂等譯，2002，北京:科學(xué)出版社)，或按照制造廠商所建議的條件。
[0018]—、遺傳群體的構(gòu)建及遺傳分析 1、供試材料
植物材料:國(guó)際公認(rèn)辣椒抗疫病材料CM334和高世代純合感病材料10399，均由美國(guó)新墨西哥州立大學(xué)辣椒遺傳育種專家Paul ff.Bosland教授贈(zèng)予。CM334和10399雜交(正反交)獲得F1, F1自交得F 2，回交得BC1F1，用作遺傳分析和定位群體。
[0019]菌種材料:辣椒疫霉菌株Byl4，從廣州鐘落潭實(shí)驗(yàn)基地發(fā)病辣椒植株上分離獲得，分離方法參照李智軍等(2007)。接種前按鄭小波等(1990)敘述的方法配制游動(dòng)孢子接種液。
[0020]2、表型鑒定
待鑒定材料種植于55mmX 55mmX 70mm穴孔中，于無(wú)疫霉菌污染的溫室中正常管理生長(zhǎng)至4-6片真葉時(shí)轉(zhuǎn)移到人工氣候箱，于接種前12小時(shí)澆透水。采用灌根法接種，接種濃度為14個(gè)游動(dòng)孢子/ml，于距植株根際I?2cm處用注射器小心注入5ml游動(dòng)孢子的懸浮液，黑暗保濕24小時(shí)后正常管理。接種后待感病對(duì)照10399開(kāi)始發(fā)病時(shí)進(jìn)行調(diào)查，此后每天調(diào)查一次，待感病對(duì)照全部發(fā)病萎焉時(shí)(接種后約10天)停止調(diào)查。表型評(píng)價(jià)參照Monroy-Barbosa and Bosland (2008)，沒(méi)有出現(xiàn)病癥的植株為抗病株，出現(xiàn)病癥的植株為感病株。
[0021]3、遺傳分析