一種(3r,5s)-6-氯-3,5-二羥基己酸叔丁酯的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物制藥和生物化工技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種(3R，5S)-6-氯-3，5_二羥基己酸叔丁酯的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]氯-3，5-二羥基己酸叔丁酯是一種化工原料，是合成暢銷藥物羅蘇伐他汀(Rosuvastatin)的關(guān)鍵手性中間體，其結(jié)構(gòu)如圖1所示。
[0003]氯-3，5-二羥基己酸叔丁酯的常見合成方法如圖2所示，其關(guān)鍵步驟在于合成3-位的手性羥基中心，將含有羰基的前體(S)-6-氯-5-羥基-3-羰基己酸叔丁酯直接還原成手性醇無疑是較為理想的方法，該反應(yīng)的方法主要有化學(xué)法和生物法。化學(xué)法例如Angew.Chem.1nt.Ed.2000, 39:4306-4307報道(圖3)，低溫下使用易燃易爆試劑，環(huán)境友好性不高，產(chǎn)物de值只有93%，難以應(yīng)用。生物法又可以分為整細胞法和游離酶法，整細胞催化雖然可以進行該類反應(yīng)(如圖4所示)，但是存在著底物濃度低(低于50 g/L)，酶用量大(>50 g/L), ee值低(95%)的問題，如《化學(xué)反應(yīng)工程與工藝》，2006，26:554-559和 Korean J.Chem.Eng., 2013，30:166-171。游離的酮還原酶(ketoreductase)催化此類反應(yīng)具有環(huán)保高效的特點(如圖5所示)，如WO 2008042876報道了利用酮還原酶催化(S)-6-氯-5-羥基-3-羰基己酸叔丁酯的還原，同時添加葡萄糖脫氫酶(⑶H)和葡萄糖進行輔酶的循環(huán)。但是需要用較貴的三乙醇胺緩沖溶液，同時用4 N氫氧化鈉溶液進行滴定，底物濃度低(13 g/L)，酶用量大(KRED 3.3%，GDH 3.3%，輔酶0.67%)，產(chǎn)物收率低(66.7%)ο專利201210465633.0采用不同的輔酶循環(huán)體系，即利用酮還原酶自身氧化異丙醇循環(huán)輔酶，底物濃度100 g/L，酶用量為4%。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種成本低的(3R，5S) -6-氯_3，5_二羥基己酸叔丁酯的制備方法。
[0005]為解決以上技術(shù)問題，本發(fā)明采取如下技術(shù)方案:
一種(3R，5S ) -6-氯-3，5-二羥基己酸叔丁酯的制備方法，其以(S) -6-氯-5-羥基-3-羰基己酸叔丁酯為底物，該底物在生物催化劑、輔酶和輔酶再生系統(tǒng)的存在下發(fā)生還原反應(yīng)生成(3R，5S) -6-氯-3，5-二羥基己酸叔丁酯，所述的生物催化劑為酮還原酶，所述的輔酶為NADP，所述的輔酶再生系統(tǒng)為葡萄糖和葡萄糖脫氫酶，所述的還原反應(yīng)在酶保護試劑的存在下、25°C~30°C下、在磷酸鹽緩沖液中進行，并通過加入碳酸鈉溶液控制反應(yīng)體系的PH值為6.0-8.0，在反應(yīng)起始時的反應(yīng)體系中，所述的底物濃度為150g/L以上，所述的酮還原酶、所述的輔酶、所述的葡萄糖、所述的葡萄糖脫氫酶、所述的底物的投料質(zhì)量比為 0.01-0.05:0.001-0.003:1.5-1.8:0.007-0.009:1。
[0006]具體地，所述的制備方法的實施過程如下:將所述的底物(S) -6-氯-5-羥基-3-羰基己酸叔丁酯、所述的葡萄糖加至裝有所述的磷酸鹽緩沖溶液的反應(yīng)器中，然后向所述的反應(yīng)器中加入所述的酮還原酶、所述的葡萄糖脫氫酶、所述的酶保護試劑、所述的NADP，然后加入所述的碳酸鈉溶液控制反應(yīng)體系的pH值，攪拌反應(yīng)，利用HPLC/MS檢測反應(yīng)進程，反應(yīng)結(jié)束后加入乙酸乙酯進行多次萃取，合并有機相，旋蒸獲得產(chǎn)物(3R, 5S) -6-氯-3，5-二羥基己酸叔丁酯。
[0007]具體地，所述的磷酸鹽緩沖液的濃度為45~55mmol/L，pH值為6~7。
[0008]更具體地，所述的磷酸鹽緩沖液的濃度為49~51mmol/L，pH值為6.4-6.6。
[0009]具體地，所述的碳酸鈉溶液的質(zhì)量百分比濃度為10%~30%。
[0010]具體地，控制反應(yīng)體系的pH值為6.0-6.5。
[0011]具體地，在反應(yīng)起始時的反應(yīng)體系中，所述的底物濃度為250g/L~300 g/L。
[0012]具體地，在反應(yīng)起始時的反應(yīng)體系中，所述的酮還原酶、所述的輔酶、所述的葡萄糖、所述的葡萄糖脫氫酶、所述的底物的投料質(zhì)量比為0.02-0.03:0.0015-0.0025:1.6-1.7:0.008-0.0085:lo
[0013]具體地，所述的酮還原酶為購自蘇州漢酶生物技術(shù)有限公司的牌號為EW005的酮還原酶。
[0014]具體地，所述的葡萄糖脫氫酶為購自蘇州漢酶生物技術(shù)有限公司的牌號為EW002的葡萄糖脫氫酶。
[0015]具體地，所述的酶保護試劑為巰基乙醇或二硫蘇糖醇，所述的酶保護試劑的投料質(zhì)量為所述的底物質(zhì)量的0.25%~1%。
[0016]由于以上技術(shù)方案的實施，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下優(yōu)點:
本發(fā)明公開了一種改進的利用酮還原酶工藝，在磷酸鹽緩沖溶液中進行反應(yīng)，采用碳酸鈉溶液進行滴定，加入酶保護試劑降低了底物對酶的失活作用，使得底物濃度提高、酶用量降低，解決了化學(xué)法生產(chǎn)(31?，5幻-6-氯-3，5-二羥基己酸叔丁酯中的產(chǎn)物光學(xué)純度低、環(huán)保和生產(chǎn)安全性低、成本高的問題；解決了以往報道的生物法生產(chǎn)(3R, 5S)-6-氯-3，5-二羥基己酸叔丁酯中的底物濃度低和酶用量大的問題，而底物濃度低及酶量大，會導(dǎo)致產(chǎn)業(yè)化效率低下，后處理純化不易，環(huán)保性差，制造成本及原材料成本過高，這也是目前諸多生物酶法產(chǎn)品無法產(chǎn)業(yè)化的根本原因；本發(fā)明克服了以上問題，大幅提高了底物濃度及減少了酶的用量，使得該產(chǎn)品生產(chǎn)環(huán)保性好，產(chǎn)業(yè)化的商業(yè)價值凸顯。
【附圖說明】
[0017]附圖1為(3R，5S)-6_氯_3，5_二羥基己酸叔丁酯的結(jié)構(gòu)式；
附圖2為(3R，5S)-6-氯-3，5-二羥基己酸叔丁酯的常見合成方法；
附圖3為(3R，5S)-6-氯-3，5-二羥基己酸叔丁酯的化學(xué)合成方法；
附圖4為(3R，5S)-6-氯-3，5-二羥基己酸叔丁酯的整細胞催化法；
附圖5為(3R，5S)-6-氯-3，5-二羥基己酸叔丁酯的酮還原酶催化法。
【具體實施方式】
[0018]下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步詳細的說明，但本發(fā)明并不限于以下實施例。實施例中采用的實施條件可以根據(jù)具體使用的不同要求做進一步調(diào)整，未注明的實施條件為常規(guī)實驗中的條件。
[0019]對比例I
底物(S)-6-氯-5-輕基-3-羰基己酸叔丁醋150 mg、葡萄糖252 mg加至裝有0.3 mL50 mM pH 6.5的磷酸鹽緩沖溶液的試管中，加入KRED(采購自蘇州漢酶，牌號EW005) 3.75mg，⑶H (采購自蘇州漢酶，牌號EW002) 1.25 mg，NADP 0.3 mg，在30°C下，分別用30%碳酸鈉溶液和4 N NaOH溶液控制pH6.5，攪拌24小時，HPLC/MS檢測轉(zhuǎn)化率分別為67.6%和80%。
[0020]對比例2
底物(S)-6-氯-5-輕基-3-羰基己酸叔丁醋150 mg、葡萄糖252 mg加至裝有0.3 mL50 mM pH 6.5的磷酸鹽緩沖溶液的試管中，加入KRED(采購自蘇州漢酶，牌號EW005) 3.75mg, GDH