程中間歇弱通風，可以提高酪氨酸的轉(zhuǎn)化率和左旋多巴的產(chǎn)量。
[0026]上述方法中，采用優(yōu)選菌種時，所得左旋多巴的含量可以達到10.5_27g/L。左旋多巴含量采用高效液相色譜法進行測定，色譜條件如下:色譜柱:C18 (4.0 X 250mm);流動相為甲醇和0.0lmol/L KH2PCV混合液，體積比為25:75，ρΗ3.0 ;流速lmL/min ;進樣量20 μ L;柱溫室溫；紫外檢測器，檢測波長280nm。
[0027]上述方法中，步驟(3)中的酶促反應(yīng)時間為8_15h。
[0028]本發(fā)明具有如下優(yōu)點:
1、本發(fā)明以L-酪氨酸為原料轉(zhuǎn)化制備左旋多巴，原料酪氨酸來源豐富、價格相對低廉，轉(zhuǎn)化周期短、操作方便，工藝流程簡單，生產(chǎn)成本低，經(jīng)濟效益顯著。
[0029]2、本發(fā)明酪氨酸轉(zhuǎn)化率高且左旋多巴含量高，反應(yīng)中無副產(chǎn)物產(chǎn)生，產(chǎn)物便于分尚提取，廣品純度尚。
[0030]3、本發(fā)明以嗜麥芽假單胞菌(Pseudomonas maltophilia )生產(chǎn)酪氨酸酶，在轉(zhuǎn)化過程中采用靜息細胞轉(zhuǎn)化技術(shù)、優(yōu)選采用間歇弱通風技術(shù)，提高了酶的催化效力，使酪氨酸轉(zhuǎn)化率和左旋多巴含量均能大大提高。當采用優(yōu)選的菌種時，左旋多巴濃度可達27g/L，酪氨酸摩爾轉(zhuǎn)化率可達99%以上，且條件溫和，對映體選擇性高，無消旋作用發(fā)生，更適合工業(yè)化生產(chǎn)，具有顯著地經(jīng)濟效益和工業(yè)應(yīng)用價值。
【具體實施方式】
[0031]下面通過具體實施例對本發(fā)明進行進一步的說明，下述說明僅是示例性的，并不對其內(nèi)容進行限制。
[0032]實施例1
(1)挑取一環(huán)嗜麥芽假單胞菌(Pseudomonasmaltophilia )ATCC17806 (市購，下同)的菌種斜面接入裝有50ml種子培養(yǎng)基的500ml三角瓶中，30°C，180r/min培養(yǎng)24h，成為一級種子；
(2)將種子液以5%的接種量接入裝有3L發(fā)酵培養(yǎng)基的自動發(fā)酵罐中，發(fā)酵期間主要參數(shù)控制如下:攪拌轉(zhuǎn)速500?700r/min，溶氧40?50%，溫度30°C，pH7.0，培養(yǎng)36h得發(fā)酵液，8000r/min、0°C離心1min收獲濕細胞(即菌體細胞，下同)210g ；
(3)配制100mL0.2mol乙酸-乙酸鈉緩沖液，pH5.0，加入1g酪氨酸、50g濕細胞混合均勾，再依次加入曲拉通lg、抗壞血酸10g、硫酸銅0.2g，在30°C，pH5.0條件下進行酶促反應(yīng)8h，取樣酸溶后HPLC測左旋多巴含量為10.5g/L，對酪氨酸摩爾轉(zhuǎn)化率為96.4%。色譜條件如下:色譜柱:C18(4.0X250mm);流動相為甲醇和0.01mol/L KH2PCV混合液，體積比為25:75, ρΗ3.0 ;流速lmL/min ;進樣量20 μ L ;柱溫室溫;紫外檢測器，檢測波長280nm。
[0033]種子培養(yǎng)基為(wt%):葡萄糖1.5%，蛋白胨0.5%，氯化鈉0.5%，氯化銨0.3%，玉米漿1%，豆餅水解液1%，水余量，pH7.0o
[0034]發(fā)酵培養(yǎng)基為(wt%):葡萄糖2%，氯化銨0.7%，硫酸鎂0.04%，磷酸二氫鉀0.1%，氯化鈣0.01%，硫酸銅0.02%，玉米漿1%，豆餅水解液0.3%，水余量，ρΗ7.0。
[0035]實施例2
(1)挑取一環(huán)嗜麥芽假單胞菌(Pseudomonasmaltophilia )ATCC17806的菌種斜面接入裝有50ml種子培養(yǎng)基的500ml三角瓶中，30°C，180r/min培養(yǎng)24h，成為一級種子；
(2)將種子液以10%的接種量接入裝有3L發(fā)酵培養(yǎng)基的自動發(fā)酵罐中，發(fā)酵期間主要參數(shù)控制如下:攪拌轉(zhuǎn)速200?300r/min，溶氧20?30%，溫度30°C，pH7.0，培養(yǎng)36h得發(fā)酵液，8000r/min、0°C離心1min收獲濕細胞220g ；
(3)配制100mL0.2mol乙酸-乙酸鈉緩沖液，pH5.4，加入20g酪氨酸、50g濕細胞混合均勾，再依次加入曲拉通lg、抗壞血酸16g、硫酸銅0.2g，在30°C，pH5.5條件下進行酶促反應(yīng)14h，取樣酸溶后HPLC測左旋多巴含量為19.6g/L，對酪氨酸摩爾轉(zhuǎn)化率為90%。色譜條件同實施例1。
[0036]種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基同實施例1。
[0037]實施例3
(1)挑取一環(huán)嗜麥芽假單胞菌(Pseudomonasmaltophilia )ATCC17806的菌種斜面接入裝有50ml種子培養(yǎng)基的500ml三角瓶中，30°C，180r/min培養(yǎng)24h，成為一級種子；
(2)將種子液以7%的接種量接入裝有2L發(fā)酵培養(yǎng)基的自動發(fā)酵罐中，發(fā)酵期間主要參數(shù)控制如下:攪拌轉(zhuǎn)速200?700r/min，溶氧20?50%，溫度30 °C，pH7.0，培養(yǎng)36h，發(fā)酵結(jié)束8000r/min、0°C離心1min收獲濕細胞150g ；
(3)配制100mL0.2mol乙酸-乙酸鈉緩沖液，pH5.4，加入20g酪氨酸(酪氨酸分5次加入，每2.5h加I次，每次4g)、40g濕細胞混合均勻，再依次加入曲拉通lg、抗壞血酸15g、硫酸銅0.2g，在25°C，pH5.4條件下進行酶促反應(yīng)14h，取樣酸溶后HPLC測左旋多巴含量為20.lg/L，對酪氨酸摩爾轉(zhuǎn)化率為92.3%。色譜條件同實施例1。
[0038]種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基同實施例1。
[0039]實施例4
(1)挑取一環(huán)嗜麥芽假單胞菌(Pseudomonasmaltophilia )ATCC17806的菌種斜面接入裝有50ml種子培養(yǎng)基的500ml三角瓶中，30°C，180r/min培養(yǎng)24h，成為一級種子；
(2)將種子液以5%的接種量接入裝有2L發(fā)酵培養(yǎng)基的自動發(fā)酵罐中，發(fā)酵期間主要參數(shù)控制如下:攪拌轉(zhuǎn)速200?700r/min，溶氧20?50%，溫度30 °C，pH7.0，培養(yǎng)36h，發(fā)酵結(jié)束8000r/min、0°C離心1min收獲濕細胞130g ；
(3)配制100mL0.2mol乙酸-乙酸鈉緩沖液，pH5.8，加入25g酪氨酸(酪氨酸分5次加入，每2.5h加I次，每次5g)、60g濕細胞混合均勾，再依次加入曲拉通lg、抗壞血酸15g、硫酸銅0.2g，在25°C，pH5.8條件下進行酶促反應(yīng)，反應(yīng)過程中間歇弱通風，每小時通空氣15min，通氣量0.2vvm,反應(yīng)15h，取樣酸溶后HPLC測左旋多巴含量為26.8g/L，對酪氨酸摩爾轉(zhuǎn)化率為98.4%。色譜條件同實施例1。
[0040]種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基同實施例1。
[0041]實施例5
(1)挑取一環(huán)嗜麥芽假單胞菌(Pseudomonasmaltophilia )ATCC17806的菌種斜面接入裝有50ml種子培養(yǎng)基的500ml三角瓶中，30°C，180r/min培養(yǎng)24h，成為一級種子；
(2)將種子液以10%的接種量接入裝有3L發(fā)酵培養(yǎng)基的自動發(fā)酵罐中，發(fā)酵期間主要參數(shù)控制如下:攪拌轉(zhuǎn)速200?700r/min，溶氧20?50%，溫度30 °C，pH7.0，培養(yǎng)36h，發(fā)酵結(jié)束8000r/min、0°C離心1min收獲濕細胞200g ；
(3)配制100mL0.2mol乙酸-乙酸鈉緩沖液，pH5.4，加入25g酪氨酸(酪氨酸分5次加入，每2.5h加I次，每次5g)、60g濕細胞混合均勻，再依次加入曲拉通lg、抗壞血酸20g、硫酸銅0.2g，在26°C，pH5.4條件下進行酶促反應(yīng)，反應(yīng)過程中間歇弱通風，每小時通空氣20min，通氣量0.2vvm,反應(yīng)15h，取樣酸溶后HPLC測左旋多巴含量為27g/L，對酪氨酸摩爾轉(zhuǎn)化率為99.2%。色譜條件同實施例1。
[0042]種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基同實施例1。
[0043]實施例6
按照實施例3的方法轉(zhuǎn)化制備左旋多巴，不同的是，步驟(3)按照以下方式進行:配制100mL 0.2mol乙酸-乙酸鈉緩沖液，ρΗ5.4，加入20g酪氨酸(酪氨酸分5次加入，每2.5h加I次，每次4g)、40g濕細胞混合均勾，再依次加入曲拉通lg、抗壞血酸15g、硫酸銅0.2g,在25°C，pH5.4條件下進行酶促反應(yīng)，反應(yīng)過程中間歇弱通風，每小時通空氣15min，通氣量為0.5vvm，反應(yīng)14h，，取樣酸溶后HPLC測左旋多巴含量為21.2g/L，對酪氨酸摩爾轉(zhuǎn)化率為97.4%。色譜條件同實施例1。
[0044]實