結(jié)合irf5的細(xì)胞穿透肽的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明包括結(jié)合干擾素調(diào)節(jié)因子5 (IRF5)和破壞IRF5同源二聚化和/或減弱下 游信號(hào)傳導(dǎo)的細(xì)胞穿透肽，和用于篩選所述抑制IRF5的肽的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] IRF5是調(diào)節(jié)自體免疫病因?qū)W的關(guān)鍵成分，包括系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE)和IL6和 IL12的下游調(diào)控的推定治療靶標(biāo)。多種全基因組關(guān)聯(lián)研宄（GWAS)報(bào)道了 IRF5多態(tài)性與 增加的SLE風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，與現(xiàn)有的臨床前文獻(xiàn)一起提供了令人信服的理由證實(shí)阻斷IRF5功能 可能有益于 SLE 患者（Agarwal ;Cunninghame 等人；Demirci 等人；Dieud6 和 Dawidowicz) 〇 在臨床前文獻(xiàn)中提出的數(shù)據(jù)對(duì)IRF5在調(diào)節(jié)自體免疫性疾病病因的關(guān)鍵成分中的重要作 用提供了重要的線索。然而，靶向IRF5的特異工具的缺乏限制了使用針對(duì)IRF5的SiRNA 或使用IRF5基因敲除小鼠的早期革巴標(biāo)評(píng)價(jià)努力（Beal ;Feng等人；Kozyrev和Alarcon ; Krausgruber 等人；Lien 等人）。
[0003] 此外，阻斷IRF5功能將影響在表達(dá)IRF5的SLE相關(guān)細(xì)胞類型（單核細(xì)胞、巨噬 細(xì)胞、漿細(xì)胞樣樹突細(xì)胞和B細(xì)胞）中的Toll樣受體7/8/9的信號(hào)傳導(dǎo)。因此，靶向IRF5 可以通過減弱去調(diào)控的信號(hào)傳導(dǎo)，如導(dǎo)致由PDC產(chǎn)生干擾素、由單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞產(chǎn)生 IL-12, IL6和TNF α、以及由B細(xì)胞產(chǎn)生自身抗體的TLR7/8/9信號(hào)傳導(dǎo)，顯著有益于SLE或 其他自體免疫性疾病的患者，在這些疾病中IRF5信號(hào)傳導(dǎo)起顯著的作用。
[0004] 細(xì)胞穿透肽（CPP)是一類具有以相對(duì)無毒的方式運(yùn)送多種否則不通透的大分子 跨越細(xì)胞質(zhì)膜能力的肽。CPP肽通常5至約30個(gè)氨基酸（aa)長，具有陽離子、兩性、或疏水 性質(zhì)。細(xì)胞穿透肽著名的例子包括Tat、穿透素（Penetratin)和運(yùn)輸?shù)鞍祝═ransportan) (Fawell，S.等人 Proc. Natl. Acad. Sci. 1994，第 664-668 頁；Theodore, L.等人 J. Neurosci. 1995,第 7158-7167 頁；Pooga, M.等人 FASEB J. 1998,第 67-77 頁）。細(xì)胞穿 透肽如Tat可以附著至效應(yīng)肽，或者效應(yīng)肽可以固有地是細(xì)胞穿透的。固有地是細(xì)胞穿透 的效應(yīng)肽的實(shí)例包括 Arf (1-22)和 p28 等等（Johansson, H. J.等人Mol. Ther. 2007, 16(1)， 第 115-123 頁；Taylor, B. N.等人 Cancer Res. 2009, 69 (2)，第 537-546 頁）。
[0005] 為了正確地剖析IRF5的作用，并抑制靶標(biāo)二聚化，所謂的工具分子（小分子或肽） 是必要的。雖然IRF5的晶體結(jié)構(gòu)是已知的（Chen等人），但是缺乏既靶向IRF5又抑制同源 二聚化，從而調(diào)節(jié)IRF5功能的特異工具（小分子或肽）。
[0006] 本發(fā)明著重在新的細(xì)胞穿透肽，其設(shè)計(jì)成既達(dá)到靶標(biāo)、又抑制對(duì)二聚體形成（調(diào) 節(jié)核易位及功能的關(guān)鍵步驟）重要的殘基。由于缺乏生化地評(píng)估這些細(xì)胞穿透肽的直接方 法和其它靶向IRF5二聚化的工具分子，建立了新的基于FRET的生化測定法。在本專利中 描述的生化測定法鑒定了抑制IRF5二聚化的工具。
[0007] 因此，本發(fā)明一般地涉及肽，其是細(xì)胞穿透的，并具有與IRF5結(jié)合和破壞IRF5同 源二聚化和/或減弱下游信號(hào)傳導(dǎo)的能力，本發(fā)明還涉及測試、篩選和評(píng)估肽的方法，特別 是結(jié)合和/或抑制IRF5的細(xì)胞穿透肽。
【附圖說明】
[0008] 圖1 :該圖描述了示范性的本發(fā)明FRET二聚體測定法的原理和驗(yàn)證。圖IA提供了 實(shí)施例12中詳細(xì)描述的生化IRF5FRET二聚體測定法的示意圖。圖IB和IC用來驗(yàn)證生化 測定法的用途。在這些實(shí)驗(yàn)中，生物素標(biāo)簽IRF5蛋白（200nM)與等體積遞增量的6-His(以 下稱His)標(biāo)簽IRF5蛋白混合。橫坐標(biāo)代表his標(biāo)記的IRF5的濃度，縱坐標(biāo)代表發(fā)生的 TR-FRET測量值。已經(jīng)在文獻(xiàn)中表明（Royer等人，2010) S430的磷酸化促進(jìn)IRF5的二聚 化。S430D突變體被認(rèn)為是磷酸模擬物（phosphomimetic)。在圖IB中，Kd(yM)表明二聚 化的次序?yàn)镾430D :S430D〈S430D :野生型〈野生型：野生型，這些觀察結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道值一 致。圖IC示出了 S430D+R353D突變體的TR_FRET信號(hào)顯著降低，也與IRF5二聚化的預(yù)期 行為符合。
[0009] 圖2 :此圖示出結(jié)合IRF5的本發(fā)明的標(biāo)記肽。圖2A提供了實(shí)施例13中詳細(xì)描述 的直接生化結(jié)合FRET測定法的示意圖（FITC CPP結(jié)合到IRF5(222-425))。在這些實(shí)驗(yàn)中， 本發(fā)明標(biāo)記的細(xì)胞穿透肽，具體地，經(jīng)FITC標(biāo)記的形式的SEQ ID NOS 13-14和4-7(100nM) (SEQ ID NOS 16-21)與遞增濃度的N末端His (6組氨酸）-標(biāo)記的IRF5 (222-425) SEQ ID NO :22混合。以下圖2B和2C中橫坐標(biāo)代表his標(biāo)記的IRF5 (222-425,缺少螺旋5,并且不 能同源二聚化）的濃度（μ M)，縱坐標(biāo)表示在經(jīng)FITC標(biāo)記的形式的SEQ ID NOS 13-14和 4-7 (SEQ ID NOS 16-21)存在下，TR-FRET的測定值。Kd表明所有六種FITC形式的SEQ ID NOS 13-14和4-7 (SEQ ID NOS 16-21)直接結(jié)合所測試的IRF5蛋白。設(shè)計(jì)為不結(jié)合IRF5 的對(duì)照經(jīng)FITC標(biāo)記的CPP (SEQ ID NO :23)不顯示任何親合力。
[0010] 圖3 :此圖表示在HeLa細(xì)胞中孵育2小時(shí)（h)(圖3A)和24小時(shí)（h)(圖3B)后， 經(jīng) FITC 標(biāo)記的 CPP' s (CPP 是 SEQ ID NO :13-14 和 4-7, FITC-標(biāo)記的形式的 SEQ ID NOS 13-14和4-7是SEQ ID NOS 16-21)的定位，并由此確認(rèn)測試的CPP是細(xì)胞穿透的。所使用 的方案詳細(xì)描述在實(shí)施例14。簡言之，HeLa細(xì)胞用10 μ M或3 μ M濃度的FITC標(biāo)記的CPP 處理2小時(shí)和24小時(shí)時(shí)間點(diǎn)（分別為圖A和圖Β)。在40χ放大下獲得圖像。
[0011] 圖4 :該圖示出了與對(duì)照（V)相比SEQ ID NOS 13-14和4-7減弱在THP-I (人單 核細(xì)胞系）中IL-6的生產(chǎn)。如實(shí)施例15所述，THP-I細(xì)胞用50 μ M的這些CPP' s (SEQ ID NO :13-14和4-7)預(yù)處理30分鐘，并用10μΜ R848(TLR7/8激動(dòng)劑）ο/η刺激。橫坐標(biāo)表示 處理?xiàng)l件，縱坐標(biāo)表示歸一化至載體（沒有肽但用10 μ M R848刺激）的產(chǎn)生的IL6量和如 通過細(xì)胞滴度glo測定的細(xì)胞數(shù)。SEQ ID NO :13-14和4-7都減弱R848刺激的IL6生產(chǎn)。
[0012] 圖5A-5F :這_圖示出了 SEQ ID NO 13-14和4-7以濃度依賴的方式減弱R848誘 導(dǎo)的人外周血單核細(xì)胞（PMBC)中的IL-12生產(chǎn)。如實(shí)施例16所述，用SEQ ID NO 13-14和 4-7預(yù)處理從健康人類志愿者中分離的PBMC 30分鐘，并用1 μ M R848 (TLR7/8激動(dòng)劑）o/n 刺激。橫坐標(biāo)表示使用的化合物濃度，縱坐標(biāo)表示IL12的量。SEQ ID NO 13-14和4-7都 以濃度依賴的方式減弱R848刺激的PBMC的IL-12生產(chǎn)。效力的次序?yàn)镾EQ ID NO :14〈SEQ ID NO ：4<SEQ ID NO ：6<SEQ ID NO ：5<SEQ ID NO ：7<SEQ ID NO ：13〇
[0013]
[0014] 除非另有定義，否則本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域 的普通技術(shù)人員通常理解的相同含義。盡管在實(shí)踐或測試本發(fā)明時(shí)可以使用類似或等同于 本文描述的方法和材料，如下描述了合適的方法和材料。
[0015] 除非另有說明，在本申請(qǐng)中使用的命名法是基于IUPAC系統(tǒng)命名法。
[0016] 除非另外指出，本文提及的所有肽序列都根據(jù)常規(guī)慣例寫入，由此N末端氨基酸 在左邊和C-末端氨基酸在右邊。兩個(gè)氨基酸殘基之間的短線表示肽鍵。當(dāng)氨基酸具有異 構(gòu)體形式時(shí)，除非另有明確指示，其是所表示氨基酸的L型。
[0017] 術(shù)語"氨基酸"是指通式Nh2CHRCOOH的有機(jī)化合物，其中R可以是任何有機(jī)基團(tuán)。 具體地，術(shù)語氨基酸可以指天然和非天然（人造）氨基酸。為方便描述本發(fā)明，使用對(duì)于多 種氨基酸殘基的常規(guī)和非常規(guī)縮寫。這些縮寫是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，但為了清楚在 下面列出：
[0018] ASP = D =天冬氨酸；Ala = A =丙氨酸；Arg = R =精氨酸；Asn = N =天冬酰 胺；Gly = G =甘氨酸；Glu = E =谷氨酸；Gln = Q =谷氨酰胺；His = H =組氨酸；Ile = I =異亮氨酸；Leu = L =亮氨酸；Lys = K =賴氨酸；Met = M =甲硫氨酸；Nle =正亮氨 酸；Phe = F =苯丙氨酸；Pro = P =脯氨酸；Ser = S =絲氨酸；Thr = T =蘇氨酸；Trp = W =色氨酸；Tyr = Y =酪氨酸；和Val = V =繳氨酸。
[0019] 術(shù)語"氨基酸基序"是指氨基酸的保守序列（例如? ---L--V)。該序列還可以包 括空隙，以指示分隔基序的每個(gè)氨基酸的殘基的數(shù)目。
[0020] 本發(fā)明的細(xì)胞穿透肽（CPP)表示約5至約30個(gè)氨基酸的肽，沒有通過連接兩個(gè)或 以上非天然氨基酸而形成的橋或環(huán)狀肽的形式的構(gòu)象限制（即，其不是"訂書肽（stapled p印tide) "），并且其能夠穿透細(xì)胞膜（例如使不同物質(zhì)易位進(jìn)入細(xì)胞）。
[0021] 短語"結(jié)合IRF5的肽"或"能夠結(jié)合IRF5的肽"表示在靶標(biāo)是IRF5的生化測定 法中是陽性的（在本文中定義為IC 50〈75uM)那些肽的組。
[0022] 術(shù)語"IRF5"（干擾素調(diào)節(jié)因子5)表示蛋白質(zhì)，其通常包含如下的氨基酸序列
[0023] MNQSIPVAPTPPRRVRLKPWLVAQVNSCQYPGLQWVNGEKKLFCIPWRHATRHGPSQD⑶NTIFKAWAK ETGKYTEGVDEADPAKWKANLRCALNKSRDFRLIYDGPRDMPPQPYKIYEVCSNGPAPTDSQPPEDYSFGAGEEEEE EEELQRMLPSLSLTEDVKWPPTLQPPTLRPPTLQPPTLQPPVVLGPPAPDPSPLAPPPGNPAGFRELLSEVLEPGPL PASLPPAGEQLLPDLLISPHMLPLTDLEIKFQYRGRPPRALTISNPHGCRLFYSQLEATQEQVELFGPISLEQVRFP SPEDIPSDKQRFYTNQLLDVLDRGLILQLQGQDLYAIRLCQCKVFffSGPCASAHDSCPNPIQREVKTKLFSLEHFLN ELILFQKGQTNTPPPFEIFFCFGEEWPDRKPREKKLITVQVVPVAARLLLEMFSGELSWSADSIRLQISNPDLKDRM VEQFKELHHIWQSQQRLQPVAQAPPGAGLGVGQGPWPMHPAGMQ(同種型 1，SEQ ID N0:11)。備選地， IRF5表示至少包括同種型2、3或4的其他同種型。
[0024] 術(shù)語"可藥用的鹽"是指不是生物學(xué)或其它方面不期望的鹽?？伤幱玫柠}包括酸 和堿加成鹽。
[0025] 術(shù)語"可藥用的酸加成鹽"表示與無機(jī)酸（如鹽酸，氫溴酸，硫酸，硝酸，碳酸，磷 酸），和選自脂肪族，環(huán)脂族，芳族，araliphatic，雜環(huán)，羧酸的有機(jī)酸，和有機(jī)酸的磺酸類 (如甲酸，乙酸，丙酸，乙醇酸，葡糖酸，乳酸，丙酮酸，草酸，蘋果酸，馬來酸，丙二酸，琥珀酸， 富馬酸，酒石酸，檸檬酸，天冬氨酸，抗壞血酸，谷氨酸，鄰氨基苯甲酸，苯甲酸，肉桂酸，扁桃 酸，撲酸，苯乙酸，甲磺酸，乙磺酸，對(duì)甲苯磺酸和水楊酸）形成的那些可藥用的鹽。
[0026] 術(shù)語"可藥用的堿加成鹽"是指與有機(jī)堿或無機(jī)堿形成的那些可藥用的堿?？捎?的無機(jī)堿的實(shí)例包括鈉，鉀，銨，鈣，鎂，鐵，鋅，銅，錳和鋁鹽。從可藥用的有機(jī)無毒堿衍生的 鹽包括伯，仲和叔胺的鹽，取代的胺包括天然存在的取代胺的鹽，環(huán)胺和堿離子交換樹脂如 異丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺、乙醇胺、2-二乙基氨基乙醇、trimethamine、二環(huán) 己基胺、賴氨酸、精氨酸、組氨酸、咖啡因、普魯卡因、海巴明、膽堿、甜菜堿、乙二胺、葡糖胺、 甲基葡糖胺、可可堿、嘌呤、哌嗪、哌啶、N-乙基哌啶和聚胺樹脂的鹽。
[0027] 術(shù)語"藥物組合物"和"藥物制劑"（或"制劑"）可互換使用，表示這樣形式的制劑， 其形式允許包含在其中的活性成分的生物學(xué)活性是有效的，并且其不含有對(duì)施用該藥物組 合物的對(duì)象有不可接受的毒性的另外成分。
[0028] "液體組合物"是指在大氣壓下、在至少約2至約8°C的溫度下是水性或液體的組 合物。
[0029] 術(shù)語"凍干"是指通過升華和/或蒸發(fā)至不支持生物或化學(xué)反應(yīng)的水平來冷凍物 質(zhì)并然后降低水濃度的方法。
[0030] 術(shù)語"凍干的組合物"（或"凍干組合物（lyocomposition) "）表示通過液體組合 物的凍干方法獲得的或可獲得的組合物。通常其是具有小于5%的水含量的固體組合物。
[0031] 術(shù)語"重構(gòu)的組合物"是指表示與重構(gòu)介質(zhì)組合的凍干的組合物，所述重構(gòu)介質(zhì)促 進(jìn)了凍干的組合物的溶解。重構(gòu)介質(zhì)的例子包括，但不限于，注射用水（WFI)、抑菌性注射用 水（BWFI)、氯化鈉溶液（例如0· 9% (w/v)NaCl)、葡萄糖溶液（如5%葡萄糖）、包括表面活 性劑（例如〇· 01 %聚山梨醇酯20)的溶液或pH-緩沖液（如磷酸鹽緩沖液）。
[0032] 術(shù)語"無菌的"是指具有被微生物污染的概率小于10e-6的組合物或賦形劑。
[0033] 術(shù)語"可藥用的"是指在制備藥物組合物中有用的物質(zhì)的屬性，所述物質(zhì)通常是安 全，無毒的，并且不是生物學(xué)上或其它方面不期望的，并且對(duì)獸醫(yī)以及人類藥物用途是可以 接受的。
[0034] 術(shù)語"可藥用的賦形劑"，"可藥用的載體"和"治療上惰性的賦形劑"可以互換使 用，其指藥物組合物中不具有治療活性并且對(duì)施用的對(duì)象是無毒的任何可藥用的成分，如 在配制藥物產(chǎn)品中使用的崩解劑，粘合劑，填料，溶劑，緩沖劑，張力劑，穩(wěn)定劑，抗氧化劑， 表面活性劑，載體，稀釋劑或潤滑劑。
[0035] 術(shù)語"半數(shù)最大抑制濃度"（IC50)是指在體外獲得抑制50%生物過程所需的 特定化合物或分子的濃度。IC50值可對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換為pIC 50值（-log IC50)，其中數(shù)值越 高指數(shù)地表示效力更大。IC50值不是絕對(duì)值，而是取決于實(shí)驗(yàn)條件如使用的濃度。使用 Cheng-Prusoff 方程（Biochem. Pharmacol. (1973)22 :3099) IC50 值可以被轉(zhuǎn)換為絕對(duì)抑制 常數(shù)（Ki)。
[0036] "自體免疫性疾病"是指從個(gè)體自身組織產(chǎn)生并且針對(duì)個(gè)體自身組織的非惡性疾 病或病癥。自體免疫性疾病在本文中明確排除惡性或癌性疾病或病癥，特別是不包括B細(xì) 胞淋巴瘤，急性淋巴細(xì)胞白血?。ˋLL)，慢性淋巴細(xì)胞白血?。–LL)，毛狀細(xì)胞白血病和慢 性成髓細(xì)胞白血病。自體免疫性疾病或病癥的實(shí)例包括，但不限于，炎性反應(yīng)，如包括銀肩 病和皮炎（例如特應(yīng)性皮炎）的炎癥性皮膚病；系統(tǒng)性硬皮病和硬化癥；與炎性腸疾?。ㄈ?克羅恩氏病和潰瘍性結(jié)腸炎）相關(guān)的反應(yīng)；呼吸窘迫綜合征（包括成人呼吸窘迫綜合癥； ARDS);皮炎；腦膜炎；腦炎；葡萄膜炎；結(jié)腸炎；腎小球腎炎；變應(yīng)性病癥如濕瘆和哮喘，和 涉及T細(xì)胞浸潤和慢性炎癥反應(yīng)的其它病癥；動(dòng)脈粥樣硬化；白細(xì)胞粘附缺陷；類風(fēng)濕性 關(guān)節(jié)炎；系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE)(包括但不限于狼瘡腎炎，皮膚狼瘡）；糖尿?。ɡ鏘型 糖尿病或胰島素依賴型糖尿?。?；多發(fā)性硬化癥；雷諾氏綜合征；自體免疫性甲狀腺炎；橋 本氏甲狀腺炎；過敏性腦脊髓炎；干燥綜合征；青少年發(fā)病型糖尿??；和與急性和遲發(fā)性超 敏反應(yīng)相關(guān)的免疫反應(yīng)，其由通常出現(xiàn)在結(jié)核病、結(jié)節(jié)病、多發(fā)性肌炎、肉芽腫和血管炎中 的細(xì)胞因子和T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)；惡性貧血（阿狄森氏病）；涉及白細(xì)胞滲出的疾??；中樞神 經(jīng)系統(tǒng)（CNS)炎性病癥；多器官損傷綜合征；溶血性貧血（包括但不限于冷沉球蛋白血癥 (cryoglobinemia)或庫姆斯陽性貧血）；重癥肌無力；抗原-抗體復(fù)合物介導(dǎo)的疾?。豢鼓I 小球基底膜?。豢沽字C合征；過敏性神經(jīng)炎；Graves'?。籐ambert-Eaton肌無力綜合征； 大皰性類天皰瘡；天皰瘡；自體免疫性多發(fā)性內(nèi)分泌疾?。籖eiter氏??；僵人綜合征；白塞 氏??；巨細(xì)胞動(dòng)脈炎；免疫復(fù)合物腎炎；IgA