酶的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及性質(zhì)改善的酶，以及適用于生產(chǎn)食品、飲料（啤酒）、飼料或生物燃料 (例如在釀造工藝中）的包含所述的酶的組合物。
【背景技術(shù)】
[0002] 在啤酒生產(chǎn)中使用酶是公知的。將酶應(yīng)用于糖化步驟中以改善糖化醪的過濾性并 增加提取產(chǎn)率在WO 97/42302中有所描述。
[0003] W02005118769和W02005059084涉及啤酒生產(chǎn)工藝中的糖化和過濾步驟，并涉及 用于該工藝中的酶組合物。
[0004] W01999057325涉及繩狀青霉（Penicillium funiculosum)菌株，由該菌株得到的 新的酶混合物以及其核心序列。
[0005] 但是，仍需要改善的酶，以及用于食品和飲料產(chǎn)品的生產(chǎn)（例如酒精飲料（例如啤 酒或威士忌）生產(chǎn)中的糖化、烹飪和過濾步驟）中的酶的組合。
[0006] 發(fā)明目的
[0007] 本發(fā)明的實(shí)施方案的目的是提供適用于食品和飲料產(chǎn)品的生產(chǎn)的酶，例如酒精或 非酒精飲料（例如與基于谷物或麥芽的飲料類似的啤酒或威士忌）的生產(chǎn)。所提供的酶具 有與釀造用途有關(guān)的改善的性質(zhì)。這些種類多樣的改善的性質(zhì)包含例如改善的最適溫度， 改善的對(duì)可溶的（WE-AX)與不可溶的（WU-AX)阿拉伯木聚糖底物的活性比，在釀造工藝的 濾除和/或過濾步驟中形成的總壓力降低，以及經(jīng)酶處理的材料的過濾性增加。
[0008] 發(fā)明概述
[0009] 本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)一種或多種酶以及酶的某些組合相對(duì)于已知的酶和酶的組合具有 改善的性質(zhì)，特別是與釀造工藝中的用途有關(guān)，其中在所述的釀造工藝中使用所述一種或 多種酶處理含淀粉的材料，產(chǎn)生釀造糖化醪。
[0010] 因此，在第一個(gè)方面中，本發(fā)明涉及表現(xiàn)出內(nèi)切-1，4-β -木聚糖酶活性的酶，該 酶包含與選自以下的任意一者具有至少80%的一致性的氨基酸序列，或它們的任何功能片 段：SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID Ν0:6、 SEQ ID NO: 17,SEQ ID NO: 18,SEQ ID NO: 19,SEQ ID NO:20,SEQ ID N0:2USEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25。 toon] 如本文所用，"功能片段"是指截短形式的酶，其具有與未截短的參照酶基本相同 的或者至少為有效程度的酶活性。
[0012] 在第二個(gè)方面中，本發(fā)明涉及表現(xiàn)出內(nèi)切-1，3 (4)-β-葡聚糖酶活性的酶，該酶 包含與選自以下的任意一者具有至少80%的一致性的氨基酸序列，或它們的任何功能片 段：SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:8、SEQ ID N0:9、SEQ ID NO: 10,和 SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16。
[0013] 在第三個(gè)方面中，本發(fā)明涉及DNA構(gòu)建體，其包含編碼根據(jù)本發(fā)明的酶的DNA序 列。
[0014] 在另一個(gè)方面中，本發(fā)明涉及包含DNA構(gòu)建體的重組表達(dá)載體，其中所述的DNA構(gòu) 建體包含編碼根據(jù)本發(fā)明的酶的DNA序列。
[0015] 在另一個(gè)方面中，本發(fā)明涉及使用DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，其中所述的DNA構(gòu)建體 包含編碼根據(jù)本發(fā)明的酶的DNA序列。
[0016] 在另一個(gè)方面中，本發(fā)明涉及包含根據(jù)本發(fā)明的酶、DNA構(gòu)建體、載體或細(xì)胞的制 備物。
[0017] 在另一個(gè)方面中，本發(fā)明涉及組合物，其包含根據(jù)本發(fā)明的表現(xiàn)出內(nèi) 切-1，4- β -木聚糖酶活性的酶、以及任意一種或多種β -葡聚糖酶。
[0018] 在另一個(gè)方面中，本發(fā)明涉及組合物，其包含根據(jù)本發(fā)明的表現(xiàn)出內(nèi) 切-1，3 (4) - β -葡聚糖酶活性的酶、以及任意一種或多種木聚糖酶。
[0019] 在另一個(gè)方面中，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的酶、或根據(jù)本發(fā)明的制備物或根據(jù)本 發(fā)明的組合物在食品、飼料或麥芽飲料產(chǎn)品（例如啤酒或威士忌）生產(chǎn)中的用途。
[0020] 在另一個(gè)方面中，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的酶、或根據(jù)本發(fā)明的制備物或根據(jù)本 發(fā)明的組合物在生面團(tuán)或烘焙產(chǎn)品的生產(chǎn)中的用途。
[0021] 在另一個(gè)方面中，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的酶、或根據(jù)本發(fā)明的制備物或根據(jù)本 發(fā)明的組合物在紙漿或紙的制備中的用途。
[0022] 在另一個(gè)方面中，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的酶、或根據(jù)本發(fā)明的制備物或根據(jù)本 發(fā)明的組合物在谷物成分的制備中的用途。在一些實(shí)施方案中，谷物為黑麥、小麥或大麥。
[0023] 在另一個(gè)方面中，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的酶、或根據(jù)本發(fā)明的制備物或根據(jù)本 發(fā)明的組合物在啤酒生產(chǎn)或釀造工藝副產(chǎn)物的改性中的用途。
[0024] 在另一個(gè)方面中，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的酶、或根據(jù)本發(fā)明的制備物或根據(jù)本 發(fā)明的組合物在葡萄酒或果汁的生產(chǎn)中的用途。
[0025] 在另一個(gè)方面中，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的酶、或根據(jù)本發(fā)明的制備物或根據(jù)本 發(fā)明的組合物在一代或二代生物燃料例如生物乙醇的生產(chǎn)中的用途。
[0026] 在另一個(gè)方面中，本發(fā)明涉及改變含淀粉材料的過濾性的方法，該方法包括使用 根據(jù)本發(fā)明的酶、制備物或組合物來處理所述的含淀粉材料的步驟。
[0027] 在另一個(gè)方面中，本發(fā)明涉及降低在釀造應(yīng)用的濾除過程中產(chǎn)生的壓力的方法， 該方法包括使用根據(jù)本發(fā)明的酶、制備物或組合物來處理釀造糖化醪的步驟。
[0028] 在另一個(gè)方面中，本發(fā)明涉及食品、飼料或飲料產(chǎn)品（例如酒精或非酒精飲料，例 如與基于谷物或麥芽的飲料類似的啤酒或威士忌）的生產(chǎn)方法，該方法包括使用根據(jù)本發(fā) 明的酶、制備物或組合物來處理含淀粉材料的步驟。
[0029] 在另一個(gè)方面中，本發(fā)明涉及用于生產(chǎn)釀造糖化醪的方法，該方法包括使用根據(jù) 本發(fā)明的酶、制備物或組合物來處理含淀粉材料的步驟。
[0030] 在另一個(gè)方面中，本發(fā)明涉及用于生產(chǎn)一代或二代生物燃料例如生物乙醇的方 法，該方法包括使用根據(jù)本發(fā)明的酶、制備物或組合物來處理含淀粉材料的步驟。
[0031] 在另一個(gè)方面中，本發(fā)明涉及通過根據(jù)本發(fā)明的方法獲得的產(chǎn)物。
[0032] 在另一個(gè)方面中，本發(fā)明涉及組合物，其包含通過根據(jù)本發(fā)明的方法獲得的產(chǎn)物， 例如其中所述的產(chǎn)物為〇. 1% -99. 9%。
[0033] 圖例
[0034] 圖I :試驗(yàn)室規(guī)模和中試規(guī)模釀造中使用的糖化圖譜。糖化是以IOmin糖化期為 開始，其后加入酶。
[0035] 圖2 :中試規(guī)模的釀造應(yīng)用產(chǎn)生于葡聚糖酶和木聚糖酶篩選的證實(shí)。針對(duì)空白和 UltraFlo max來檢驗(yàn)枯草芽胞桿菌（B. sub)葡聚糖酶S和A. tub木聚糖酶。收集的數(shù)據(jù)為 平均流速（L/h)，經(jīng)過濾除過程的形成的總壓力（mm WC，其中Imm WC = 9. 80665 Pa)以及 在濾除過程中的最大壓力（mm WC)。
[0036] 33圖3 :釀造中木聚糖酶的功能性。
[0037] 34圖4 :濾除流速，其中施加多種木聚糖酶的候選物。
[0038] 35圖5 :啤酒過濾-重復(fù)過濾的平均值。
[0039] 36圖6 :啤酒過濾-重復(fù)過濾的平均值。
[0040] 圖7 :實(shí)施例3的糖化克數(shù)。
[0041] 本發(fā)明的詳細(xì)公開
[0042] 在傳統(tǒng)上，啤酒是指由麥芽（例如由大麥粒得到的麥芽）、和可任選的附屬物（例 如含淀粉的植物材料（例如谷物谷粒）和可任選的加入風(fēng)味劑（例如可加入啤酒花）得到 的酒精飲料。
[0043] 就本發(fā)明而言，術(shù)語"啤酒"是指包含通過發(fā)酵/釀造含淀粉的植物材料而生產(chǎn)的 任何發(fā)酵的麥芽汁，因此也特別包含專門由附屬物、或者麥芽和附屬物的任何組合所生產(chǎn) 的啤酒。
[0044] 就本發(fā)明而言，術(shù)語"發(fā)酵"是指通過使微生物在培養(yǎng)物中生長(zhǎng)來生產(chǎn)諸如乙醇之 類的物質(zhì)。通常諸如酵母之類的微生物可用于發(fā)酵。
[0045] 如本文所用，術(shù)語"麥芽"可理解為任何發(fā)芽的谷物谷粒，例如發(fā)芽的大麥。"附屬 物"可定義為并非為麥芽或大麥麥芽的任何含淀粉的植物材料。
[0046] "含淀粉的植物材料"可以為例如一種或多種谷物，例如大麥、小麥、玉米、黑麥、高 粱、小米或大米和它們的任意組合。含淀粉的植物材料可以被加工，例如研磨的、發(fā)芽的、部 分發(fā)芽的或未發(fā)芽的。未發(fā)芽的谷物也稱為"天然谷粒"。非谷物的含淀粉植物材料的實(shí)例 包括例如塊莖，例如馬鈴薯和木薯。
[0047] 如本文所用，術(shù)語"飲料"和"飲料產(chǎn)物"包括形成泡沫的發(fā)酵的飲料，例如全麥啤 酒、在"純凈法（Reinheitsgebot) "下釀造的啤酒、愛爾啤酒、干啤酒、淡啤酒、清淡啤酒、低 醇啤酒、低熱量啤酒、波特啤酒、博克啤酒、黑啤酒、麥芽酒、無醇啤酒、無醇麥芽酒等。此外， 術(shù)語"飲料"或"飲料產(chǎn)物"還包括不起沫的啤酒和備選的麥芽飲料，例如果味的麥芽飲料， 例如柑橘風(fēng)味的，例如檸檬、橙子、青檸或漿果風(fēng)味的麥芽飲料；酒味的麥芽飲料，例如伏特 加、朗姆或龍舌蘭風(fēng)味的麥芽酒；或者咖啡風(fēng)味的麥芽飲料，例如咖啡因風(fēng)味的麥芽酒等。 [0048] 可以通過基本相同的工藝由多種含淀粉的植物材料來制得啤酒，其中所述的淀粉 主要由葡萄糖均聚物組成，在該均聚物中，葡萄糖殘基通過α-1,4-或α-1,6-鍵連接，并 且主要為α-1,4-鍵。
[0049] 制造發(fā)酵的飲料（例如啤酒）的工藝通常稱為釀造。在制造這些飲料中使用的傳 統(tǒng)的原材料為水、啤酒花和麥芽。此外或者代替麥芽，諸如普通玉米粒、精制玉米渣、釀造 者的酵母粉、大米、高粱、精制玉米淀粉、大麥、大麥淀粉、脫殼大麥、小麥、小麥淀粉、烘焙谷 物、谷物片、黑麥、燕麥、馬鈴薯、木薯粉、糖漿（例如玉米糖漿、甘蔗糖漿、轉(zhuǎn)化糖漿、大麥和 /或小麥糖漿）等之類的附屬物可以用作淀粉的來源。淀粉最終通過酶促而轉(zhuǎn)化成可發(fā)酵 的糖。
[0050] 關(guān)于主要由麥芽（例如至多達(dá)到15-20%附屬物）制造的啤酒，由于多種原因，使 得麥芽（主要由所選種類的大麥生產(chǎn)）對(duì)啤酒的整體特征和品質(zhì)產(chǎn)生最大的影響。首選， 麥芽是啤酒中主要的風(fēng)味劑。第二，麥芽提供了可發(fā)酵的糖的主要部分。第三，麥芽提供了 蛋白質(zhì)，這有助于啤酒的主體和泡沫特征。第四，麥芽提供了糖化過程中必須的酶活性。
[0051] 此外，啤酒花還極其有助于啤酒的品質(zhì)，包含風(fēng)味。具體而言，啤酒花（或啤酒花 的構(gòu)成部分）將所需的苦味物質(zhì)加入到啤酒中。此外，啤酒花起到了蛋白質(zhì)沉淀劑的作用， 形成了防腐劑，并有助于泡沫的形成和穩(wěn)定。并非所有的啤酒都是使用啤酒花生產(chǎn)的。諸 如蛋白酶（例如木瓜蛋白酶）之類的其他穩(wěn)定劑也可以使用。
[0052] 不想解釋為限宙本發(fā)明，以下描沭傳統(tǒng)的釀?wù)a工藝：
[0053] 用于制造啤酒的工藝是本領(lǐng)域公知的，但是簡(jiǎn)言之，該工藝涉及5個(gè)步驟：(a)糖 化和/或附屬物的烹飪；(b)麥芽汁的分離和提取；(C)麥芽汁的煮沸并加入啤酒花；（d)冷 卻、發(fā)酵和儲(chǔ)存；以及（e)成熟、加工和包裝。通常，在第一個(gè)步驟中，將研磨或壓碎的麥芽 與水混合，在受控的溫度下保持一段時(shí)間，從而使麥芽中存在的酶將麥芽中存在的淀粉轉(zhuǎn) 化成可發(fā)酵的糖。
[0054] 在第二個(gè)步驟中，糖化醪被轉(zhuǎn)移至"過濾桶"或糖化醪過濾器中，在此，液體與谷粒 殘余物分離