尿液外泌小體mRNA和使用其檢測糖尿病型腎病的方法
【專利說明】
[0001] 相關(guān)案件
[0002] 本申請要求2012年10月5日提交的美國臨時申請系列號61/710, 627的好處，其 全部公開內(nèi)容通過引用并入本文。
[0003] 背景
技術(shù)領(lǐng)域
[0004] 本公開大體上涉及與糖尿病型腎病相關(guān)的各種生物標(biāo)記的鑒定。數(shù)個實施方式 涉及糖尿病型腎病的診斷，并且，更具體地，本公開涉及從源自尿液的外泌小體分離的mRNA 的鑒定和使用，以及它們在糖尿病型腎病的鑒定和持續(xù)監(jiān)測中的應(yīng)用。
[0005] 相關(guān)摶術(shù)的描沐
[0006] -般來說，腎的功能在于過濾血液中的各種代謝廢物和過多的水。每天，成年人的 腎過濾約200夸脫的血液，導(dǎo)致產(chǎn)生并排泄約2夸脫的廢物和額外的水。腎的功能單位是 腎單位，并且每個腎包括約1百萬個腎單位。每個腎單位內(nèi)是腎小球，其用作過濾裝置，其 保留血流中的正常蛋白質(zhì)和/或細胞，并且允許過多的水和廢物穿過而被剩余的腎單位處 理（例如，濃縮或稀釋）。盡管一些腎功能的喪失是可以忍受的-許多個體可用僅僅一個腎 過正常生活-但是在許多情況下腎功能的下降是由于進行性疾病或損傷。在極端情況下， 腎功能的進行性喪失導(dǎo)致需要腎替代療法，比如透析或甚至腎移植。腎功能喪失的兩個最 常見的原因是糖尿病和高血壓。根據(jù)美國糖尿病協(xié)會的最新數(shù)據(jù)，超過8%的美國人口是患 糖尿病的。由于糖尿病造成的晚期腎病，超過200, 000人依靠長期透析或依靠腎移植生活。 這不僅僅給患者本人而且給他們的家庭和醫(yī)療保健系統(tǒng)造成巨大的成本。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 在數(shù)個實施方式中，提供了鑒定受試者可能發(fā)展成糖尿病型腎病或目前遭受糖尿 病型腎病的方法，該方法包括獲得來自受試者的尿液樣品，其中所述樣品包括與RNA結(jié)合 的囊泡，從所述樣品分離所述囊泡，使所述囊泡裂解以釋放囊泡結(jié)合的RNA，其中所述囊泡 結(jié)合的RNA包括與糖尿病誘導(dǎo)的對腎單位的損傷相關(guān)的RNA，其中與糖尿病誘導(dǎo)的對腎單 位的損傷相關(guān)的RNA選自由PPARGC1A、SMAD1、UM0D、NRF2、SLC12A1和CD24組成的組，量化 與糖尿病誘導(dǎo)的對腎單位的損傷相關(guān)的RNA，將來自所述受試者的與糖尿病誘導(dǎo)的對腎單 位的損傷相關(guān)的RNA的量與來自具有正常腎功能個體的相應(yīng)RNA的數(shù)量進行比較，當(dāng)所述 受試者的與糖尿病誘導(dǎo)的對腎單位的損傷相關(guān)的RNA的數(shù)量和具有正常腎功能的個體中 RNA的數(shù)量之間有差異時，鑒定受試者可能發(fā)展或目前遭受糖尿病型腎病。在數(shù)個實施方式 中，通過下述方法進行量化，所述方法包括使來自所述樣品的RNA接觸逆轉(zhuǎn)錄酶，以產(chǎn)生互 補0嫩(。0嫩），和（^)使。0嫩接觸對？卩六1?(：認、5嫩01、通00、順卩2、5^：12六1和〇024之一 特異性的正義引物和反義引物以及DNA聚合酶，以產(chǎn)生擴增的DNA。其后，可量化所述mRNA 的表達水平（使用擴增的DNA作為替代品）。
[0008] 在數(shù)個實施方式中，所述方法進一步包括基于出現(xiàn)的結(jié)果向受試者施用療法。例 如，可單獨或結(jié)合膳食、訓(xùn)練或生活方式的改變而施用藥物療法。另外，也可施用透析。在 一些實施方式中，進行腎移植。
[0009] 也提供了鑒定受試者遭受糖尿病型腎病的方法，包括獲得來自受試者的尿液樣 品，其中所述樣品包括與RNA結(jié)合的囊泡，從所述樣品分離所述囊泡，使所述囊泡裂解以釋 放所述囊泡結(jié)合的RNA，其中所述囊泡結(jié)合的RNA包括與糖尿病誘導(dǎo)的對腎單位的損傷相 關(guān)的RNA，其中所述與糖尿病誘導(dǎo)的對腎單位的損傷相關(guān)的RNA選自由PPARGC1A、SMAD1、 UMOD、NRF2、SLC12A1和CD24組成的組，量化所述與糖尿病誘導(dǎo)的對腎單位的損傷相關(guān)的 RNA，并將來自所述受試者的所述與糖尿病誘導(dǎo)的對腎單位的損傷相關(guān)的RNA的量與來自 具有正常腎功能個體的相應(yīng)RNA的數(shù)量進行比較，其中所述受試者和所述個體之間與糖尿 病誘導(dǎo)的對腎單位的損傷相關(guān)的RNA的數(shù)量之間的差異指示所述受試者遭受糖尿病型腎 病。
[0010] 而且，另外提供了測定患者的糖尿病型腎病病情發(fā)展的方法，包括在第一時間獲 得來自患者的第一尿液樣品和在第一時間之后的第二時間獲得來自患者的第二尿液樣 品；其中所述樣品包括與RNA結(jié)合的囊泡，從所述樣品分離所述囊泡，使所述囊泡裂解以 釋放囊泡結(jié)合的RNA，其中所述囊泡結(jié)合的RNA包括與糖尿病誘導(dǎo)的對腎單位的損傷相關(guān) 的至少一種RNA和不因糖尿病誘導(dǎo)的對腎單位的損傷而改變的至少一種RNA，其中所述與 糖尿病誘導(dǎo)的對腎單位的損傷相關(guān)的至少一種RNA選自由PPARGC1A、SMAD1、UMOD、NRF2、 SLC12A1、⑶24及其組合組成的組，量化所述與糖尿病誘導(dǎo)的對腎單位的損傷相關(guān)的至少一 種RNA和所述不因糖尿病誘導(dǎo)的對腎單位的損傷而改變的至少一種RNA，測定所述與糖尿 病誘導(dǎo)的對腎單位的損傷相關(guān)的至少一種RNA的量和所述不因糖尿病誘導(dǎo)的對腎單位的 損傷而改變的至少一種RNA的量之間的比例，當(dāng)與所述第一樣品相比，所述第二樣品中所 述與糖尿病誘導(dǎo)的對腎單位的損傷相關(guān)的至少一種RNA與所述不因糖尿病誘導(dǎo)的對腎單 位的損傷而改變的至少一種RNA的比例增加時，確認所述患者的糖尿病型腎病病情發(fā)展。 [0011] 另外提供了基于核酸檢測早期糖尿病型腎病的方法，包括獲得來自受試者的尿液 樣品，其中所述樣品包括與RNA結(jié)合的囊泡，從所述樣品分離所述囊泡，使所述囊泡裂解 以釋放囊泡結(jié)合的RNA，其中所述囊泡結(jié)合的RNA包括與糖尿病誘導(dǎo)的對腎單位的損傷相 關(guān)的RNA，其中所述與糖尿病誘導(dǎo)的對腎單位的損傷相關(guān)的RNA選自由PPARGC1A、SMAD1、 UMOD、NRF2、SLC12A1和CD24組成的組，量化所述與糖尿病誘導(dǎo)的對腎單位的損傷相關(guān)的 RNA，將來自所述受試者的所述與糖尿病誘導(dǎo)的對腎單位的損傷相關(guān)的RNA的量與來自具 有正常腎功能個體的相應(yīng)RNA的數(shù)量進行對比，其中所述受試者和所述個體之間與糖尿病 誘導(dǎo)的對腎單位的損傷相關(guān)的RNA的數(shù)量之間的差異指示早期糖尿病型腎病，從而檢測早 期糖尿病型腎病。在數(shù)個實施方式中，該檢測能在利用非核酸檢測方法檢測之前實現(xiàn)。
[0012] 在數(shù)個實施方式中，提供建議受試者進行糖尿病型腎病的治療方案的方法，包括 安排受試者的尿液的檢測，該檢測包括獲得來自受試者的尿液樣品，其中所述樣品包括與 RNA結(jié)合的囊泡，從所述樣品分離所述囊泡，使所述囊泡裂解以釋放所述囊泡結(jié)合的RNA， 其中所述囊泡結(jié)合的RNA包括與糖尿病誘導(dǎo)的對腎單位的損傷相關(guān)的RNA，其中所述與糖 尿病誘導(dǎo)的對腎單位的損傷相關(guān)的RNA選自由PPARGC1A、SMAD1、UMOD、NRF2、SLC12A1和 CD24組成的組，量化所述與糖尿病誘導(dǎo)的對腎單位的損傷相關(guān)的RNA，將來自所述受試者 的所述與糖尿病誘導(dǎo)的對腎單位的損傷相關(guān)的RNA的量與來自具有正常腎功能個體的相 應(yīng)RNA的數(shù)量進行對比，當(dāng)所述受試者的所述與糖尿病誘導(dǎo)的對腎單位的損傷相關(guān)的RNA 的數(shù)量和所述具有正常腎功能的個體中RNA的數(shù)量之間有差異時，表征所述受試者可能發(fā) 展或目前遭受糖尿病型腎病，當(dāng)表征為可能發(fā)展或目前遭受糖尿病型腎病時，建議所述受 試者進行糖尿病型腎病的療法。在數(shù)個實施方式中，所述療法包括膳食、訓(xùn)練、透析和/或 生活方式改變的一個或多個。
[0013] 另外提供了治療具有糖尿病型腎病的受試者的方法，包括獲得來自受試者的尿液 樣品，其中所述樣品包括與RNA結(jié)合的囊泡，從所述樣品分離所述囊泡，使所述囊泡裂解 以釋放囊泡結(jié)合的RNA，其中所述囊泡結(jié)合的RNA包括與糖尿病誘導(dǎo)的對腎單位的損傷相 關(guān)的RNA，其中所述與糖尿病誘導(dǎo)的對腎單位的損傷相關(guān)的RNA選自由PPARGC1A、SMAD1、 UMOD、NRF2、SLC12A1和CD24組成的組，量化所述與糖尿病誘導(dǎo)的對腎單位的損傷相關(guān)的 RNA，將來自所述受試者的所述與糖尿病誘導(dǎo)的對腎單位的損傷相關(guān)的RNA的量與來自具 有正常腎功能個體的相應(yīng)RNA的數(shù)量進行對比，當(dāng)所述受試者的所述與糖尿病誘導(dǎo)的對腎 單位的損傷相關(guān)的RNA的數(shù)量和所述具有正常腎功能的個體中RNA的數(shù)量之間有差異時， 表征受試者目前遭受糖尿病型腎病，向所述施用療法以治療糖尿病型腎病。在數(shù)個實施方 式中，所述療法包括膳食、訓(xùn)練、透析和/或生活方式改變的一個或多個。
[0014] 在數(shù)個實施方式中，通過使用下述方法實現(xiàn)RNA的量化，所述方法選自由逆轉(zhuǎn)錄 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR)、實時RT-PCR、RNA測序、RNA印跡、熒光激活細胞分選、ELISA和質(zhì) 譜分析組成的組。也可任選地使用其他量化方法。在數(shù)個實施方式中，量化包括實時RT-PCR 的使用。
[0015] 在數(shù)個實施方式中，與糖尿病誘導(dǎo)的對腎單位的損傷相關(guān)的RNA的數(shù)量差異與糖 尿病型腎病的一個或多個非分子指示劑相關(guān)聯(lián)。在這種實施方式中，可通過使用非分子手 段證實初步分子診斷。
[0016] 在數(shù)個實施方式中，與糖尿病誘導(dǎo)的對腎單位的損傷相關(guān)的RNA選自由 PPARGC1A、SMAD1、UM0D和SLC12A1組成的組。在數(shù)個實施方式中，這些標(biāo)記還未以其他方式 表達或可檢測，直到使用本文公開的方法鑒定，從而允許對腎單位的損傷的早期檢測（例 如，在表現(xiàn)出確切的癥狀之前）。
[0017] 在數(shù)個實施方式中，從樣品分離囊泡包括將尿液過濾。在數(shù)個實施方式中，過濾將 囊泡捕獲在過濾器上。以囊泡被捕獲在過濾器上的狀態(tài)進行裂解。
[0018] 在數(shù)個實施方式中，方法進一步包括離心尿液樣品（或多個樣品）以去除細胞