一種微生物發(fā)酵高三尖杉酯堿的提取方法和應用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物工程領(lǐng)域，具體涉及微生物發(fā)酵，發(fā)酵產(chǎn)物的提取、分離和純化方 法，特別涉及一種微生物發(fā)酵高三尖杉酯堿的提取方法和應用。
【背景技術(shù)】
[0002] 高三尖杉醋堿（Homoharringtonine，HHT)是從三尖杉屬（Cephalotaxus)植物中 分離到的一種具有抗腫瘤活性的天然生物堿。由于其廣泛得抗腫瘤活性，高三尖杉酯堿及 其衍生物已被用于白血病、乳腺癌、肝癌等多種腫瘤的臨床研宄與疾病的治療，并顯示出較 好的療效。在2012年，人工半合成的高三尖杉醋堿一 Omacetaxine Mepesuccinate被美國 FDA批準用于治療人慢性粒細胞性白血病。
[0003] 目前商業(yè)應用的高三尖杉酯堿主要為人工合成/半合成品或從三尖杉植物中提 取。由于三尖杉生長緩慢、繁殖困難和近年來的過度采伐，天然來源的高三尖杉酯堿資源幾 近枯竭，而人工合成工藝復雜、成本高。來源不足與生產(chǎn)的高成本已成為限制高三尖杉酯堿 研宄與應用的瓶頸問題。
[0004] 專利201210541494. 5公開了一種高三尖杉酯堿側(cè)鏈酸、其類似物的全合成方法， 其包括9項合成步驟，總收率41 %，其中的6項合成步驟需要經(jīng)柱層析純化后再進行下步合 成，合成步驟復雜，反應條件較難控制，成本高。專利02150323. 0公開了一種三尖杉酯堿與 高三尖杉酯堿的提取方法，方法以三尖杉植物為原料，采用CO2超臨界流體萃取，4步吸附、 離子樹脂柱層析，再通過高速逆流色譜分離純化，結(jié)晶、重結(jié)晶后得到三尖杉酯堿和高三尖 杉酯。該方法設(shè)備要求高、工藝復雜，而且需以三尖杉植物為原料，其來源稀缺，不適于生產(chǎn) 制備。
[0005] 生物發(fā)酵生產(chǎn)是一些藥用成分如抗生素等獲取的理想方法，其具有可持續(xù)性、可 大規(guī)模生產(chǎn)和低成本等的優(yōu)勢。近年來，產(chǎn)三尖杉酯堿的微生物陸續(xù)有報道。但是，如何從 菌體以及發(fā)酵液中高效提取高純度的三尖杉酯堿仍然有待解決。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 鑒于現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明通過試驗研宄，提供了一種微生物發(fā)酵高三尖杉酯 堿的提取方法和應用。
[0007] 第一方面，本發(fā)明公開了一種微生物發(fā)酵高三尖杉酯堿的提取方法，包括如下步 驟：
[0008] (1)對微生物發(fā)酵物進行分離，得菌體和去除菌體的發(fā)酵液，將去除菌體的發(fā)酵 液濃縮，調(diào)PH值為7. 0-10. 0,有機溶劑萃取得有機相并蒸干，所得固體復溶解于pH為 3.0-10.0復溶緩沖溶液（復溶緩沖溶液的體積優(yōu)選為原發(fā)酵液體積的1/100-1/1000)中， 得粗提液；
[0009] (2)將步驟（1)所得粗提液采用大孔樹脂或活性炭進行吸附、解吸附得生物堿粗 提取物；
[0010] (3)步驟（2)所得生物堿粗提取物經(jīng)高效液相純化獲得高三尖杉酯堿；
[0011] 或步驟（2)所得生物堿粗提取物先經(jīng)硅膠柱層析純化得高三尖杉酯堿粗品；高三 尖杉酯堿粗品再經(jīng)高效液相純化獲得高三尖杉酯堿。
[0012] 在本發(fā)明的一些實施方案中，所述步驟（1)中，所述微生物為發(fā)酵產(chǎn)高三尖杉酯 堿的細菌、真菌，優(yōu)選為保藏號CGMCC No. 4443的細極鏈格孢CH1307。
[0013] 在本發(fā)明的一些實施方案中，所述步驟（1)中，將去除菌體的發(fā)酵液濃縮至原體 積的 20% -2%。
[0014] 在本發(fā)明的一些實施方案中，所述步驟（1)中，濃縮后調(diào)發(fā)酵液pH值為7. 0-10.0， 優(yōu)選的為7.0-8. 0。
[0015] 在本發(fā)明的一些實施方案中，所述步驟（1)中，所述有機溶劑為正己烷、二氯甲 烷、三氯甲烷、乙醚、乙酸乙酯中的一種或多種，優(yōu)選為三氯甲烷。
[0016] 在本發(fā)明的一些實施方案中，所述步驟（1)中，所述有機溶劑萃取次數(shù)為2-4次， 優(yōu)選為4次，并合有機相。
[0017] 在本發(fā)明的一些優(yōu)選實施方案中，所述步驟（1)中，所述萃取用的有機溶劑的用 量為濃縮后發(fā)酵液體積的2-1/4倍，優(yōu)選為1/4。
[0018] 在本發(fā)明的一些實施方案中，所述步驟（1)中，復溶緩沖溶液為pH為7. 0-10. 0的 堿性復溶緩沖溶液；進一步優(yōu)選為pH為9. 0的堿性復溶緩沖溶液。
[0019] 本發(fā)明采用的復溶緩沖溶液可以為行業(yè)內(nèi)常規(guī)的酸堿緩沖液，酸性條件優(yōu)選檸檬 酸緩沖溶液或醋酸緩沖液，但不限于此；堿性條件優(yōu)選采用氨-氯化銨緩沖液或碳酸鈉緩 沖液，但不限于此。
[0020] 在本發(fā)明的一些實施方案中，提取微生物發(fā)酵物進行分離后所得的菌體中的高三 尖杉酯堿的方法中，步驟（2)和步驟（3)與"對去除菌體的發(fā)酵液的提取方法一樣，不同的 是步驟（1);對于菌體來說，步驟（1)的處理方法為：先將菌體破壁（優(yōu)選將菌體置研缽中 充分研磨或采用超聲波破碎儀破壁3min-5min);在堿性條件下（pH 7.5-10.0)有機溶劑 萃?。▋?yōu)選按20-2mL有機溶劑/Ig菌體濕重的比例靜置浸提，進一步地，萃取時間優(yōu)選為 12-36h)后過濾；濾液蒸干后復溶（優(yōu)選為：與原菌體重量比（w:v)為1/100~1/1000體 積的復溶緩沖溶液，即lg/l〇〇ml - lg/1000ml)，得粗提液。
[0021] 在本發(fā)明的一些實施方案中，所述步驟（2)中，所述大孔樹脂為極性、中極性、弱 極性和非極性大孔樹脂中的一種或多種。
[0022] 優(yōu)選地，所述極性大孔樹脂極性優(yōu)選為NKA-9、S8和HPD500中的一種或多種，但不 限于此。
[0023] 優(yōu)選地，所述中極性大孔樹脂極性優(yōu)選為HPD850、HPD750和HPD400A中的一種或 多種，但不限于此。
[0024] 優(yōu)選地，所述弱極性大孔樹脂極性優(yōu)選為AB-8、HPD450和HPD722中的一種或多 種，但不限于此。
[0025] 優(yōu)選地，所述非極性大孔樹脂極性優(yōu)選為D3520、D4020、X-5和NKA中的一種或多 種，但不限于此。
[0026] 進一步地，在本發(fā)明的一些更為優(yōu)選的實施方案中，所述步驟（2)中，所述極性大 孔樹脂極性優(yōu)選為NKA-9 ;所述中極性大孔樹脂極性優(yōu)選為HPD850 ;所述弱極性大孔樹脂 極性優(yōu)選為HPD450 ;所述非極性大孔樹脂極性優(yōu)選為D3520。
[0027] 在本發(fā)明的一些實施方案中，所述步驟（2)中，所述的采用大孔樹脂或活性炭進 行吸附的方式為靜態(tài)吸附。
[0028] 在本發(fā)明的一些實施方案中，所述步驟（2)中，所述的采用大孔樹脂或活性炭進 行吸附的時間為〇. 5-2小時。
[0029] 在本發(fā)明的一些實施方案中，所述步驟（2)中，所述的采用大孔樹脂或活性炭進 行吸附時，所述大孔樹脂或活性炭的用量按如下比例添加：lg大孔樹脂或活性炭/5_50mL 粗提液。
[0030] 在本發(fā)明的一些實施方案中，所述步驟⑵中，解吸附所用緩沖液為pH為 3. 0-10. 0的解吸附緩沖溶液，進一步優(yōu)選為pH為3. 0-6. 0的酸性解吸附緩沖溶液；更進一 步優(yōu)選為pH為5. 0的酸性解吸附緩沖溶液。
[0031] 本發(fā)明采用的解吸附緩沖溶液可以為行業(yè)內(nèi)常規(guī)的酸堿緩沖液與有機溶劑的混 合溶液（體積比為1:1-1:4,優(yōu)選為3:7)，酸性條件的酸堿緩沖液優(yōu)選檸檬酸緩沖溶液或醋 酸緩沖液，但不限于此；堿性條件的酸堿緩沖液優(yōu)選采用氨-氯化銨緩沖液或碳酸鈉緩沖 液，但不限于此；其中，有機溶劑優(yōu)選為甲醇、乙醇或丙酮中的一種或多種，但不限于此。
[0032] 在本發(fā)明的一些實施方案中，所述步驟（2)中，解吸附的時間為2-4小時。
[0033] 在本發(fā)明的一些實施方案中，所述步驟（3)中，硅膠柱層析條件為：100-300目硅 膠，流動相為甲醇：二氯甲烷（體積比為40 :60-10 :90)，紫外檢測波長288nm。
[0034] 在本發(fā)明的一些實施方案中，所述步驟（3)中，高效液相條件為：C18柱，流動相 0· 02mol/L乙酸銨：甲醇（體積比為90:10-50 :50)紫外檢測波長288nm。
[0035] 采用本發(fā)明第一方面提供的技術(shù)方案，可獲得純度高達97%以上的高三尖杉酯堿 (HHT)，可便于后續(xù)進一步的純化處理。
[0036] 第二方面，本發(fā)明公開了一種微生物發(fā)酵高三尖杉酯堿的預提取方法，包括如下 步驟：
[0037] (1)對微生物發(fā)酵物進行分離，得菌體和去除菌體的發(fā)酵液，將去除菌體的發(fā)酵 液濃縮，調(diào)PH值為7. 0-10. 0,有機溶劑萃取得有機相并蒸干，所得固體復溶解于pH為 3.0-10.0復溶緩沖溶液（復溶緩沖溶液的體積優(yōu)選為原發(fā)酵液體積的1/100-1/1000)中， 得粗提液；
[0038] (2)將步驟（1)所得粗提液采用大孔樹脂或活性炭進行吸附、解吸附得生物堿粗 提取物。
[0039] 在本發(fā)明的一些實施方案中，所述步驟（1)中，所述微生物為發(fā)酵產(chǎn)高三尖杉酯 堿的細菌、真菌，優(yōu)選為保藏號CGMCC No. 4443的細極鏈格孢CH1307。
[0040] 在本發(fā)明的一些實施方案中，所述步驟（1)中，將去除菌體的發(fā)酵液濃縮至原體 積的20%-2%。在本發(fā)明的一些實施方案中，所述步驟（1)中，濃縮后調(diào)發(fā)酵液pH值為 7. 0-10. 0,優(yōu)選的為 7. 0-8. 0。
[0041] 在本發(fā)明的一些實施方案中，所述步驟（1)中，所述有機溶劑為正己烷、二氯甲 烷、三氯甲烷、乙醚、乙酸乙酯中的一種或多種，優(yōu)選為三氯甲烷。
[0042] 在本發(fā)明的一些實施方案中，所述步驟（1)中，所述有機溶劑萃取次數(shù)為2-4次， 優(yōu)選為4次，并合有機相。
[0043] 在本發(fā)明的一些優(yōu)選實施方案中，所述步驟（1)中，所述