一種環(huán)孢菌素的合成方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于藥物合成技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種環(huán)孢菌素的合成方法。
【背景技術(shù)】
[0002]環(huán)孢菌素(又名環(huán)孢菌素A)是20世紀(jì)70年代發(fā)現(xiàn)的一組環(huán)狀i^一肽物質(zhì)，其中的環(huán)孢菌素A已作為高效免疫抑制劑廣泛應(yīng)用于器官移植，在世界市場(chǎng)的年銷售額已達(dá)到10億美元以上。環(huán)孢菌素作為高效免疫抑制劑廣泛應(yīng)用于器官移植術(shù)，它的問(wèn)世引起了器官移植領(lǐng)域的一場(chǎng)革命，使尸體來(lái)源和活體來(lái)源腎移植一年的存活率分別從53%和78%提高到80%和90%，使肝移植患者5年的存活率從原來(lái)的20%提高到70%，并使心肺聯(lián)合移植等手術(shù)得以廣泛開展。除免疫抑制作用外，環(huán)孢菌素還有一系列其它生物活性，如治療紅斑狼瘡、牛皮癬等自身免疫系統(tǒng)疾病，抑制HIV-1病毒，逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥等。
[0003]由于環(huán)孢菌素中含有多種N-甲基化氨基酸，難以用通用的多肽縮合試劑合成，目前環(huán)孢菌素的生產(chǎn)工藝均采用微生物發(fā)酵法，但是由微生物發(fā)酵法制備生產(chǎn)只能得到少數(shù)幾種環(huán)孢菌素，難以構(gòu)建藥物篩選所需的大規(guī)模多肽化合物庫(kù)。美國(guó)化學(xué)家丹尼雪夫斯基課題組在2010年嘗試以異腈縮合反應(yīng)在液相條件下合成環(huán)孢菌素A全序列。但是這種方法需要多種縮合試劑，并且在微波加熱的條件下才能縮合成功，該制備工藝苛刻、難度高，因此難以推廣應(yīng)用于快速制備環(huán)孢菌素全序列。而目前還沒(méi)有用固相多肽合成技術(shù)合成環(huán)孢菌素全序列的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種環(huán)孢菌素的合成方法，旨在解決現(xiàn)有技術(shù)合成環(huán)孢菌素條件苛刻、難度高，且無(wú)法實(shí)現(xiàn)固相合成的問(wèn)題。
[0005]本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種環(huán)孢菌素的合成方法，包括以下步驟:
[0006]提供Fmoc基團(tuán)保護(hù)的肼樹脂；
[0007]米用三光氣作為縮合試劑，固相合成H2N-Ala-MeLeu-Val-MeLeu-MeGly-Abu-MeBmt-MeVal-MeLeu-MeLeu-D-Ala-餅樹脂；
[0008]將所述H2N-Ala-MeLeu-Val-MeLeu-MeGly-Abu-MeBmt-MeVal-MeLeu-MeLeu-D-Ala-肼樹脂進(jìn)行氧化活化處理，得到環(huán)孢菌素。
[0009]本發(fā)明提供的環(huán)孢菌素的合成方法，采用三光氣作為縮合試劑，能在室溫條件下將氨基酸的羧基直接轉(zhuǎn)變?yōu)楦呋钚缘孽Ｂ龋瑥亩沟铆h(huán)孢菌素的N-甲基化氨基酸能夠在非常溫和的條件下將氨基和羧基縮合成酰胺鍵，從而使固相合成環(huán)孢菌素全序列得以實(shí)現(xiàn)；同時(shí)，本發(fā)明采用金屬制品作為環(huán)孢菌素固相合成的載體樹脂，該樹脂的特殊連接官能團(tuán)，使得合成的 H2N-Ala-MeLeu-Val-MeLeu-MeGly-Abu-MeBmt-MeVal-MeLeu-MeLeu-D-Ala-肼樹脂在氧化活化處理步驟中，可在切割的同時(shí)、直接將多肽兩端游離的氨基和羧基首尾相連形成環(huán)肽，從而一步實(shí)現(xiàn)切割和閉環(huán)反應(yīng)，簡(jiǎn)化了操作程序，同時(shí)避免了液相縮合成環(huán)過(guò)程中的多聚縮合副反應(yīng)。
【附圖說(shuō)明】
[0010]圖1是本發(fā)明實(shí)施例提供的環(huán)孢菌素合成方法流程示意圖；
[0011]圖2是本發(fā)明實(shí)施例提供的固相合成環(huán)孢菌素的工藝流程圖。
【具體實(shí)施方式】
[0012]為了使本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題、技術(shù)方案及有益效果更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0013]本發(fā)明實(shí)施例使用的英文縮寫的含義如下:
[0014]BCT:三光氣；
[0015]DCM: 二氯甲烷；
[0016]Fmoc:2，2，4，6，7_ 五甲基苯并呋喃；
[0017]NBS:N-溴代丁二酰亞胺；
[0018]DMF:N, N- 二甲基甲酰胺；
[0019]DIEA:N, N’ - 二異丙基乙胺。
[0020]本發(fā)明實(shí)施例提供了一種環(huán)孢菌素的合成方法，包括以下步驟，如圖1所示:
[0021]S01.提供Fmoc基團(tuán)保護(hù)的肼樹脂；
[0022]S02.線形肽的合成:采用三光氣作為縮合試劑，固相合成H2N-Ala-MeLeu-Val-MeLeu-MeGly-Abu-MeBmt-MeVal-MeLeu-MeLeu-D-Ala-餅樹脂；
[0023]S03.環(huán)抱菌素的合成:將所述 H2N-Ala-MeLeu-Val-MeLeu-MeGly-Abu-MeBmt-MeVa1-MeLeu-MeLeu-D-Ala-肼樹脂進(jìn)行氧化活化處理，得到環(huán)孢菌素。
[0024]具體地，上述步驟SOl中，所述肼樹脂為含有肼基的載體樹脂，本發(fā)明實(shí)施例以肼樹脂作為固相合成的載體樹脂，一方面，提供了多肽固相合成所需的活性基團(tuán)，更重要的是，米用餅樹脂偶聯(lián)得到的線性?shī)y H2N-Ala-MeLeu-Val-MeLeu-MeGly-Abu-MeBmt-MeVal-MeLeu-MeLeu-D-Ala-肼樹脂，在進(jìn)行下述步驟的裂解切割中，能直接將多肽兩端游離的氨基和羧基首尾相連形成環(huán)肽，從而一步實(shí)現(xiàn)切割和閉環(huán)反應(yīng)。
[0025]所述肼樹脂的選擇不受限制，本領(lǐng)域內(nèi)常用的肼樹脂均在本發(fā)明實(shí)施例的保護(hù)范圍內(nèi)。作為優(yōu)選實(shí)施例，所述肼樹脂可選用苯肼樹脂。
[0026]上述步驟SOl中，所述肼樹脂的替代度對(duì)后期環(huán)孢菌素組成氨基酸或氨基酸片段的偶聯(lián)率會(huì)有一定的影響。當(dāng)肼樹脂的替代度過(guò)高時(shí)，反應(yīng)基團(tuán)在樹脂上的密度過(guò)大，隨著偶聯(lián)的發(fā)生，多肽肽鏈逐漸增長(zhǎng)，因此，其空間位阻會(huì)越來(lái)越大，這將增加后續(xù)氨基酸或氨基酸片段的偶聯(lián)難度，導(dǎo)致部分肽鏈的偶聯(lián)中斷，從而降低了多肽合成的合成效率，浪費(fèi)了原料，更重要的是，在后續(xù)的裂解切割過(guò)程中，這些被中斷的肽鏈將連同環(huán)孢菌素一起切割下來(lái)，成為目的產(chǎn)物環(huán)孢菌素的雜質(zhì)，且雜質(zhì)類型多種多樣，增加了環(huán)孢菌素的純化難度；當(dāng)肼樹脂的替代度過(guò)低時(shí)，合成一定量的環(huán)孢菌素所需要的數(shù)值量將增加，從而提高了生產(chǎn)成本。為了同時(shí)解決上述問(wèn)題，經(jīng)過(guò)發(fā)明人反復(fù)研究發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明實(shí)施例所述肼樹脂的替代度為0.2?1.0mmol/go作為進(jìn)一步優(yōu)選實(shí)施例，所述肼樹脂的替代度為0.2?0.6mmol/g°
[0027]在進(jìn)行步驟S02前，上述肼樹脂需要進(jìn)行溶脹處理，所述溶脹處理采用二氯甲烷試劑進(jìn)行。溶脹處理方法不受限制，本領(lǐng)域常用方法均在本發(fā)明實(shí)施例保護(hù)范圍內(nèi)。
[0028]為了避免上述肼樹脂在偶聯(lián)氨基酸或氨基酸片段前，其反應(yīng)基團(tuán)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)失效，應(yīng)采用Fmoc保護(hù)基團(tuán)將所述肼樹脂進(jìn)行保護(hù)。
[0029]上述步驟S02 中，所述固相合成 H2N-Ala-MeLeu-Val-MeLeu-MeGly-Abu-MeBmt-MeVal-MeLeu-MeLeu-D-Ala-肼樹脂的步驟中，為了節(jié)省生產(chǎn)成本,在所述Fmoc基團(tuán)保護(hù)的肼樹脂上可采用逐一偶聯(lián)的方式依次偶聯(lián)Fmoc基團(tuán)保護(hù)的D_Ala、MeLeu、Meleu、MeVal、MeBmt、Abu、MeGly、MeLeu> Val、Meleu、Ala合成線性肽。當(dāng)然，也可以根據(jù)實(shí)際需要，將合成得到的滿足環(huán)孢菌素序列的氨基酸片段進(jìn)行Fmoc保護(hù)后，再在所述Fmoc基團(tuán)保護(hù)的肼樹脂上依次偶聯(lián)Fmoc保護(hù)的氨基酸片段。上述氨基酸片段的組合形式及其個(gè)數(shù)不受限制，只需符合環(huán)孢菌素的氨基酸序列即可。本發(fā)明實(shí)施例中，為了降低環(huán)孢菌素的合成成本，優(yōu)選采用逐一偶聯(lián)氨基酸的方式合成 H2N-Ala-MeLeu-Val-MeLeu-MeGly-Abu-MeBmt-MeVal-MeLeu-MeLeu-D-Ala-餅樹脂。本發(fā)明實(shí)施例中，上述固相合成H2N-Ala-MeLeu-Val-MeLeu-MeGly-Abu-MeBmt-MeVal-MeLeu-MeLeu-D-Ala-肼樹脂的步驟中，在每次偶聯(lián)氨基酸或氨基酸片段時(shí)，需將連載樹脂上的反應(yīng)基團(tuán)或已部分偶聯(lián)的氨基酸肽鏈進(jìn)行去除Fmoc保護(hù)處理，本發(fā)明實(shí)施例中，所述Fmoc基團(tuán)保護(hù)的去除試劑為含體積分?jǐn)?shù)為20%的哌啶的DMF。所述處理方式不受限制，本領(lǐng)域常用的去除Fmoc保護(hù)處理均能用于本發(fā)明實(shí)施例。
[0030]本發(fā)明實(shí)施例中，由于所要合成的環(huán)孢菌素中含有7個(gè)N-甲基化的氨基酸，通用的多肽縮合試劑難以合成，其液相合成難度巨大，且多肽縮合試劑需要的種類多，固相合成更是難以企及。因此，環(huán)孢菌素的合成停滯在微生物發(fā)酵法。有鑒于此，發(fā)明了經(jīng)過(guò)反復(fù)的實(shí)驗(yàn)、摸索，將用作液相反應(yīng)介質(zhì)的三光氣作為本發(fā)明實(shí)施例多肽固相合成的縮合試劑。本發(fā)明實(shí)施例中，三光氣能在室溫條件下將氨基酸的羧基直接轉(zhuǎn)變?yōu)楦呋钚缘孽Ｂ?，從而使得環(huán)孢菌素的N-甲基化氨基酸能夠在非常溫和的條件下將氨基和羧基縮合成酰胺鍵，從而使固相合成環(huán)孢菌素全序列得以實(shí)現(xiàn)。
[0031]上述固相合成步驟中，在所述Fmoc基團(tuán)保護(hù)的肼樹脂上逐一偶聯(lián)氨基酸片段或單個(gè)氨基酸的方法不受限制，本領(lǐng)域內(nèi)常用的多肽固相合成方法適用于本發(fā)明實(shí)施例。作為具體實(shí)施例，上述偶聯(lián)反應(yīng)的方法可以為將所述Fmoc基團(tuán)保護(hù)的肼樹脂加入到固相反應(yīng)柱中，采用Fmoc去除試劑脫除Fmoc保護(hù)基后，用洗滌試劑進(jìn)行清洗，洗滌試劑可采用本領(lǐng)域常用的洗滌試劑，如DMF、DCM等。取與肼樹脂摩爾質(zhì)量比為(1-3):1的