對(duì)舞毒蛾有殺蟲(chóng)活性的Bt蛋白及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及幾種對(duì)舞毒蛾具有殺蟲(chóng)活性的Bt蛋白、Bt蛋 白組合及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 舞毒蛾Lymantria dispar (Linnaeus)具有分布廣、食性雜、危害重、幼蟲(chóng)順風(fēng)迀移 等特點(diǎn)，是世界性的農(nóng)林業(yè)害蟲(chóng)。它起源于歐亞大陸，目前主要分布在亞洲、歐洲和北美洲， 在溫帶全北區(qū)曾引發(fā)大范圍的暴發(fā)。舞毒蛾在國(guó)內(nèi)幾乎各省均有分布，幼蟲(chóng)以樹(shù)葉為食，危 害多種針闊葉樹(shù)種和果樹(shù)，其寄主多達(dá)500多種，尤其是楊樹(shù)、柳樹(shù)、樺樹(shù)、楓樹(shù)、櫟樹(shù)等，甚 至危害蘋(píng)果、梨、柑桔等農(nóng)作物。有效控制舞毒蛾種群密度，使林木免受危害，是一項(xiàng)長(zhǎng)期而 艱巨的任務(wù)。
[0003] 蘇云金芽胞桿菌Bacillus thuringiensis (簡(jiǎn)稱(chēng)Bt)產(chǎn)生的伴胞晶體對(duì)鱗翅目、 鞘翅目、雙翅目等多種農(nóng)林害蟲(chóng)具有特異的殺蟲(chóng)活性，并且具有對(duì)人畜無(wú)害，不污染環(huán)境等 優(yōu)點(diǎn)，使Bt制劑成為目前世界上產(chǎn)量最多、應(yīng)用最成功的微生物殺蟲(chóng)劑。Bt蛋白特異性強(qiáng)、 種類(lèi)繁多，篩選對(duì)舞毒蛾具有高毒力的Bt蛋白和基因，將為舞毒蛾的有效控制提供新的材 料，同時(shí)新基因的發(fā)掘?qū)檗D(zhuǎn)基因植物的培育和基因工程殺蟲(chóng)劑的生產(chǎn)提供有效的基因來(lái) 源。
[0004] 另外，不同Bt蛋白基因的協(xié)同增效作用不但可以提高殺蟲(chóng)活性，而且能有效解決 和抑制Bt單價(jià)基因在應(yīng)用過(guò)程中存在的殺蟲(chóng)譜窄、害蟲(chóng)易產(chǎn)生抗性等問(wèn)題。Cry蛋白間的 協(xié)同增效作用已在多種農(nóng)林業(yè)害蟲(chóng)身上得到證實(shí)，但未見(jiàn)針對(duì)舞毒蛾的Bt蛋白的協(xié)同增 效研宄，因此，在篩選出高毒力Bt蛋白的基礎(chǔ)上，探索幾種蛋白對(duì)舞毒蛾的協(xié)同毒力作用 將進(jìn)一步提高對(duì)舞毒蛾的防治效果，將會(huì)為工程菌的構(gòu)建和轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)作物的培育提供優(yōu) 良的殺蟲(chóng)基因組合，延緩抗性產(chǎn)生。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供了幾種對(duì)舞毒蛾具有殺蟲(chóng)活性的 Bt蛋白，以期解決舞毒蛾生物防治資源的匱乏。
[0006] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，采用如下技術(shù)方案：
[0007] 本發(fā)明提供了對(duì)舞毒蛾有殺蟲(chóng)活性的Bt蛋白，所述蛋白來(lái)源于蘇云金芽胞桿菌， 所述蛋白選自CrylAc蛋白、CrylCa蛋白、Cry2Ab蛋白或Vip3Aj蛋白中的至少一種。
[0008] 本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方面，上述對(duì)舞毒蛾有殺蟲(chóng)活性的Bt蛋白是如下序列組成的 蛋白：其中，CrylAc蛋白是如下1)或2):
[0009] 1)序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白；
[0010] 2)在序列表中序列1的氨基酸序列經(jīng)過(guò)取代和/或缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨 基酸組成的且具有1)相同功能的蛋白；
[0011] CrylCa蛋白是如下3)或4):
[0012] 3)序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白；
[0013] 4)在序列表中序列2的氨基酸序列經(jīng)過(guò)取代和/或缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨 基酸組成的且具有3)相同功能的蛋白；
[0014] Cry2Ab蛋白是如下5)或6):
[0015] 5)序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白；
[0016] 6)在序列表中序列3的氨基酸序列經(jīng)過(guò)取代和/或缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨 基酸組成的且具有5)相同功能的蛋白；
[0017] Vip3Aj蛋白是如下7)或8):
[0018] 7)序列表中序列4所示的氨基酸序列組成的蛋白；
[0019] 8)在序列表中序列4的氨基酸序列經(jīng)過(guò)取代和/或缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨 基酸組成的且具有7)相同功能的蛋白。
[0020] 本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供了將上述Bt蛋白進(jìn)行兩兩配比得到的Bt蛋白組合。
[0021] 本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的方面是，上述Bt蛋白組合是對(duì)舞毒蛾具有協(xié)同增效殺蟲(chóng)效 果的Bt蛋白組合。
[0022] 進(jìn)一步地，所述蛋白組合選自CrylAc蛋白和Cry2Ab蛋白組合、CrylAc蛋白和 CrylCa蛋白組合或CrylAc蛋白和Vip3Aj蛋白組合的至少一種。
[0023] 更近一步地，所述Bt蛋白組合選自CrylAc蛋白和Cry2Ab蛋白組合或CrylAc蛋 白和CrylCa蛋白組合的至少一種。
[0024] 再更一步優(yōu)選地，所述Bt蛋白組合選自CrylAc蛋白和Cry2Ab蛋白組合。
[0025] 本發(fā)明還提供了上述的Bt蛋白和/或Bt蛋白組合在制備舞毒蛾殺蟲(chóng)劑上的應(yīng) 用。
[0026] 本發(fā)明還提供了上述的Bt蛋白和/或Bt蛋白組合在制備轉(zhuǎn)基因植物上的應(yīng)用。
[0027] 本發(fā)明還提供了含有上述的Bt蛋白和/或Bt蛋白組合的殺蟲(chóng)劑或生物制劑。
[0028] 本發(fā)明還進(jìn)一步提供了含有上述的Bt蛋白和/或Bt蛋白組合的轉(zhuǎn)基因植物。
[0029] 本發(fā)明提供的對(duì)舞毒蛾具有殺蟲(chóng)活性的幾種Bt蛋白將為舞毒蛾的有效控制提供 新的材料，同時(shí)新基因的發(fā)掘?qū)檗D(zhuǎn)基因植物的培育和基因工程殺蟲(chóng)劑的生產(chǎn)提供有效的 基因來(lái)源。
[0030] 本發(fā)明還進(jìn)一步的提供了通過(guò)上述方法篩選得到的對(duì)舞毒蛾高毒力的幾種Bt蛋 白組合，不但可以提高殺蟲(chóng)活性，而且能有效解決和抑制Bt單價(jià)基因在應(yīng)用過(guò)程中存在的 殺蟲(chóng)譜窄、害蟲(chóng)易產(chǎn)生抗性等問(wèn)題，因此有望對(duì)其進(jìn)行多基因轉(zhuǎn)基因作物的研發(fā)，治理具有 一定抗藥性的害蟲(chóng)。也將為工程菌的構(gòu)建和轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)作物的培育提供優(yōu)良的殺蟲(chóng)基因組 合。
【附圖說(shuō)明】
[0031] 圖1為^^一種蛋白SDS-PAGE電泳結(jié)果圖；其中，從左至右依次為：1為CrylAb蛋 白，2為Cry IAc蛋白，3為Cry IAh蛋白，4為Cry2Ab蛋白，5為Cry ICa蛋白，6為Cry9Ee蛋 白，7為Vip3A蛋白，8為Vip3Ag蛋白，9為Vip3Aj蛋白，10為CrylBb蛋白，11為CrylBe蛋 白，標(biāo)記物。
【具體實(shí)施方式】
[0032] 以下實(shí)施例用于進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。在不背離本 發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的前提下，對(duì)本發(fā)明所作的修飾或者替換，均屬于本發(fā)明的范疇。
[0033] 本發(fā)明所用的菌株均來(lái)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研宄所植物病蟲(chóng)害生物學(xué)國(guó) 家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。
[0034] 本發(fā)明所用到的培養(yǎng)基和試劑：
[0035] 液體1^培養(yǎng)基：1%胰蛋白胨、0.5%酵母提取物、1%氯化鈉，？!17.0，121°〇，滅菌 20min ；
[0036] 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：0. 3%牛肉膏、0. 5%大豆蛋白胨、50mmol/L Tris-Base， ρΗ7· 2,121°C，滅菌 20min ;
[0037] 裂解液：50mmol/L Na2C03 和 EDTA，ρΗ9· 5,121°C滅菌 20min ;
[0038] Tris-HCl 緩沖液：20mmol/L，ρΗ8· 0,121°C滅菌 20min ;
[0039] Na2C03:50mmol/L，ρΗ9· 5,121°C滅菌 20min ;
[0040] 實(shí)施例1
[0041] 1、蛋白制備及定量
[0042] l)CrylBb、CrylBe、Cry9Ee、Vip3Ag、