vvm，培養(yǎng)24h至菌種濃度達(dá)到（0. 2-0. 3 )X109/ml;
[0125]4)按照20% (v/v)的接種量將所述三級(jí)擴(kuò)培步驟得到的三級(jí)擴(kuò)培液接種至容積為 30立方米的含有四級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)基的四級(jí)擴(kuò)培罐中，控制溫度33°C、pH4. 8、通氣量0. 02vvm， 培養(yǎng)28h至菌種濃度達(dá)到（0. 2-0. 3)X109/ml。
[0126] 所述一級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)基、二級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)基、三級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)基和四級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)基均與 實(shí)施例4相同。
[0127] 在實(shí)施例1、3、4及對(duì)比例1、3、4中，木質(zhì)纖維素原料酶解液的原料選自玉米秸桿， 其制備方法如下：
[0128] 步驟（1):將玉米秸桿破碎為粒度為10-100mm的顆粒，將原料投入螺旋喂料器，對(duì) 其進(jìn)行擠壓脫水至干物20%_50%，形成致密的料塞，在保證纖維素原料不斷進(jìn)入處理容器的 同時(shí)還能抵御容器內(nèi)的蒸汽外泄；
[0129] 步驟（2):在步驟1中形成的料塞從螺旋喂料器處理后，向纖維素原料中混入其質(zhì) 量2 %的稀釋硫酸溶液，進(jìn)入酸混合罐混合后得到酸性纖維素原料；
[0130] 步驟（3):步驟2中的酸性纖維素原料在蒸煮處理容器中，與0. 6MPa(G)的低壓蒸 汽接觸進(jìn)行處理，處理時(shí)間在15_25min之間，然后按照一定頻率間歇泄壓排放的方式排出 容器，此過(guò)程可以打開(kāi)纖維素原料的結(jié)構(gòu)，使半纖維素部分降解，部分纖維素裸露在表面；
[0131] 步驟（4):將生物質(zhì)處理產(chǎn)物水洗，調(diào)節(jié)pH值為5.0,加熱至50°C后，以每克產(chǎn)物 的干重計(jì)，加入20-50濾紙酶活力單位的纖維素酶計(jì)算，擠入纖維素酶（諾維信有限公司提 供），并在50°C下保溫混合攪拌72h，得到所述酶解液。
[0132] 發(fā)酵產(chǎn)乙醇試驗(yàn)
[0133] 將實(shí)施例1-4和對(duì)比例1-4中培養(yǎng)得到的擴(kuò)大培養(yǎng)菌種液，均按10%接種量接至 含發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，控制發(fā)酵過(guò)程中溫度30°C，pH6. 0,轉(zhuǎn)速200rpm通入空氣，通氣 量0? 2vvm，發(fā)酵16h，檢測(cè)發(fā)酵產(chǎn)物。
[0134]所述發(fā)酵培養(yǎng)基為：葡萄糖 8wt%、木糖 4. 5wt%、KH2P04 0? 5g/L、（NH4)2HP04 2g/ L;去離子水或軟化水配置溶液，分裝滅菌,冷卻后混合。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種共發(fā)酵C5和C6生產(chǎn)乙醇微生物的擴(kuò)大培養(yǎng)方法，其特征在于，包括將培養(yǎng)所 述微生物得到的種子液接種至擴(kuò)大培養(yǎng)基中，經(jīng)至少一級(jí)的擴(kuò)大培養(yǎng)步驟對(duì)所述微生物進(jìn) 行擴(kuò)大培養(yǎng)，在所述擴(kuò)大培養(yǎng)步驟中，通過(guò)調(diào)節(jié)擴(kuò)大培養(yǎng)過(guò)程中的供氧濃度實(shí)現(xiàn)對(duì)所述微 生物的擴(kuò)大培養(yǎng)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的共發(fā)酵C5和C6生產(chǎn)乙醇微生物的擴(kuò)大培養(yǎng)方法，其特征在 于，使用一級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)步驟對(duì)所述微生物進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，包括如下步驟： 將所述種子液按5-20%的接種量接種至含有所述擴(kuò)大培養(yǎng)基的一級(jí)擴(kuò)培罐中，控制溫 度25-35°C、pH4-6. 5、轉(zhuǎn)速180-220rpm、通氣量0. 08-0. 5vvm，擴(kuò)大培養(yǎng)6-12h ;隨后調(diào)整轉(zhuǎn) 速40-100rpm、通氣量0. 18-0. 5vvm，擴(kuò)大培養(yǎng)至所述微生物濃度達(dá)到（0. 1-0. 5) X 109/mL。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的共發(fā)酵C5和C6生產(chǎn)乙醇微生物的擴(kuò)大培養(yǎng)方法，其特征在 于，使用二級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)步驟對(duì)所述微生物進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，包括如下步驟： 1) 將所述種子液按5-20%的接種量接種至含有所述擴(kuò)大培養(yǎng)基的一級(jí)擴(kuò)培罐中，控制 溫度25-35°C、pH4-6. 5、轉(zhuǎn)速180-220rpm、通氣量0. 08-0. 5vvm，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)至所述微生 物濃度達(dá)到（〇? 1-0. 5) X IO9AiL ; 2) 將步驟1)中得到的擴(kuò)培微生物按5-20%的接種量接種至含有所述擴(kuò)大培養(yǎng)基的二 級(jí)擴(kuò)培罐中，控制溫度25-35°C、pH4-6. 5、轉(zhuǎn)速40-100rpm、通氣量0? 18-0. 5vvm，進(jìn)行擴(kuò)大 培養(yǎng)至所述微生物濃度達(dá)到（〇. 1-0. 5) X109/mL。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的共發(fā)酵C5和C6生產(chǎn)乙醇微生物的擴(kuò)大培養(yǎng)方法，其特征在 于，使用三級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)步驟對(duì)所述微生物進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，包括如下步驟： 1) 將所述種子液按5-20%的接種量接種至含有所述擴(kuò)大培養(yǎng)基的一級(jí)擴(kuò)培罐中，控制 溫度25-35°C、pH4-6. 5、轉(zhuǎn)速180-220rpm、通氣量0. 08-0. 5vvm，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)至所述微生 物濃度達(dá)到（〇? 1-0. 5) X IO9AiL ; 2) 將步驟1)中得到的擴(kuò)培微生物按5-20%的接種量接種至含有所述擴(kuò)大培養(yǎng)基的二 級(jí)擴(kuò)培罐中，控制溫度25-35°C、pH4-6. 5、轉(zhuǎn)速40-100rpm、通氣量0? 18-0. 5vvm，進(jìn)行擴(kuò)大 培養(yǎng)至所述微生物濃度達(dá)到（〇. 1-0. 5) X IO9AiL ; 3) 將步驟2)中得到的擴(kuò)培微生物按5-20%的接種量接種至含有所述擴(kuò)大培養(yǎng)基的三 級(jí)擴(kuò)培罐中，控制溫度25-35°C、pH4-6. 5、轉(zhuǎn)速40-60rpm、通氣量0. 01-0. 2vvm，進(jìn)行擴(kuò)大培 養(yǎng)至所述微生物濃度達(dá)到（〇. 1-0. 5) X 109/mL。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的共發(fā)酵C5和C6生產(chǎn)乙醇微生物的擴(kuò)大培養(yǎng)方法，其特征在 于，使用四級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)步驟對(duì)所述微生物進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，包括如下步驟： 1) 將所述種子液按5-20%的接種量接種至含有所述擴(kuò)大培養(yǎng)基的一級(jí)擴(kuò)培罐中，控制 溫度25-35°C、pH4-6. 5、轉(zhuǎn)速180-220rpm、通氣量0. 08-0. 5vvm，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)至所述微生 物濃度達(dá)到（〇? 1-0. 5) X IO9AiL ; 2) 將步驟1)中得到的擴(kuò)培微生物按5-20%的接種量接種至含有所述擴(kuò)大培養(yǎng)基的二 級(jí)擴(kuò)培罐中，控制溫度25-35°C、pH4-6. 5、轉(zhuǎn)速40-60rpm、通氣量0. 18-0. 5vvm，進(jìn)行擴(kuò)大培 養(yǎng)至所述微生物濃度達(dá)到（〇. 1-0. 5) X IO9AiL ; 3) 將步驟2)中得到的擴(kuò)培微生物按5-20%的接種量接種至含有所述擴(kuò)大培養(yǎng)基的三 級(jí)擴(kuò)培罐中，控制溫度25-35°C、pH4-6. 5、轉(zhuǎn)速40-60rpm、通氣量0. 01-0. 2vvm，進(jìn)行擴(kuò)大培 養(yǎng)至所述微生物濃度達(dá)到（〇. 1-0. 5) X IO9AiL ; 4)將步驟3)中得到的擴(kuò)培微生物按5-20%的接種量接種至含有所述擴(kuò)大培養(yǎng)基的四 級(jí)擴(kuò)培罐中，控制溫度25-35°C、pH4-6. 5、通氣量0. 0005-0. 02vvm，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)至所述微 生物濃度達(dá)到（〇? 1-0. 5) X 109/mL。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1-5任一所述的共發(fā)酵C5和C6生產(chǎn)乙醇微生物的擴(kuò)大培養(yǎng)方法，其 特征在于，所述各級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)過(guò)程中，一級(jí)擴(kuò)培罐為50L擴(kuò)培罐，二級(jí)擴(kuò)培罐為500L擴(kuò)培 罐，三級(jí)擴(kuò)培罐為5立方擴(kuò)培罐，四級(jí)擴(kuò)培罐為50立方擴(kuò)培罐。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1-6任一所述的共發(fā)酵C5和C6生產(chǎn)乙醇微生物的擴(kuò)大培養(yǎng)方 法，其特征在于，所述微生物選自釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae、嗜縣管囊酵母 Pachysolen tannophilus、樹(shù)干畢赤酵母 Pichia stipitis、休哈塔假絲酵母 Candida shehatae、酒香酵母Brettanomyces naardenensis、纖細(xì)假絲酵母Candida tenuis、熱帶假 絲酵母 Candida tropical is、賽溝畢赤酵母Pichia segobiensis、多動(dòng)擬桿菌Bacteroides polypragmatus、菊歐文氏桿菌 Erwinia chrysanthem、植物克雷伯桿菌 Klebsiella planticola、嗜熱厭氧乙醇菌Thermoanaerobacter ethanolicus、球狀螺旋體Spirochaeta coccoides sp.、植物發(fā)酵梭菌 Clostridium phytofermentas sp.、尖抱鎌刀菌 Fusarium oxysporum、粗糖脈抱菌Neurospora crassa、燕麥鎌刀菌Fusarium avenaceum、運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單 胞菌 Zymomonas mobilis、大腸桿菌 Escherichia coli 以及重組釀酒酵母 S.cerevisiae、 重組運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌Zymomonas mobilis、重組大腸桿菌Escherichia coli。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1-7任一所述的共發(fā)酵C5和C6生產(chǎn)乙醇微生物的擴(kuò)大培養(yǎng)方法， 其特征在于，所述各級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)的過(guò)程中，所述擴(kuò)大培養(yǎng)基彼此獨(dú)立的含有玉米糖化醪、糖 蜜、葡萄糖、甜高粱莖桿汁或木質(zhì)纖維素原料酶解液中的一種或幾種做為碳源；含有黃豆餅 粉、玉米餅粉、玉米漿、魚(yú)粉、酵母膏中的一種或幾種做為氮源；并且選擇性的含有尿素、無(wú) 機(jī)鹽、氨基酸、微量元素和/或抑制劑。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1-8任一所述的共發(fā)酵C5和C6生產(chǎn)乙醇微生物的擴(kuò)大培養(yǎng)方法，其 特征在于，所述種子液為將所述微生物接種至種子培養(yǎng)基中，經(jīng)12-24h培養(yǎng)至所述微生物 濃度達(dá)到（〇? 1-0. 5) X 109/ml。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的共發(fā)酵C5和C6生產(chǎn)乙醇微生物的擴(kuò)大培養(yǎng)方法，其特征在 于：所述種子培養(yǎng)基包括酵母粉l_15g/L、蛋白胨l-25g/L、葡萄糖15-25g/L，經(jīng)分裝滅菌后 混合制備得到。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供一種共發(fā)酵C5和C6生產(chǎn)乙醇微生物的擴(kuò)大培養(yǎng)方法，包括將培養(yǎng)所述微生物得到的種子液接種至擴(kuò)大培養(yǎng)基中，經(jīng)至少一級(jí)的擴(kuò)大培養(yǎng)步驟對(duì)所述微生物進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，在所述擴(kuò)大培養(yǎng)步驟中，通過(guò)調(diào)節(jié)擴(kuò)大培養(yǎng)過(guò)程中的供氧濃度實(shí)現(xiàn)對(duì)所述微生物的擴(kuò)大培養(yǎng)。
【IPC分類(lèi)】C12R1-72, C12R1-19, C12N1-20, C12R1-84, C12R1-145, C12R1-865, C12N1-14, C12P7-06, C12N1-16, C12R1-18, C12R1-645, C12R1-77, C12R1-22, C12R1-74, C12N1-18, C12R1-01
【公開(kāi)號(hào)】CN104745499
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201310752782
【發(fā)明人】李凡, 沈乃東, 林鑫, 蘇會(huì)波, 彭超, 熊強(qiáng), 林海龍, 李春玲, 袁敬偉, 劉文信, 岳國(guó)君
【申請(qǐng)人】中糧營(yíng)養(yǎng)健康研究院有限公司, 中糧生化能源（肇東）有限公司, 中糧集團(tuán)有限公司
【公開(kāi)日】2015年7月1日
【申請(qǐng)日】2013年12月31日