一種弓形蟲蛋白TgVP1單克隆抗體雜交瘤1D7及單克隆抗體的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及細(xì)胞工程領(lǐng)域，具體涉及弓形蟲蛋白TgVPl單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株 1D7及單克隆抗體。
【背景技術(shù)】
[0002] V-H+-PPase是一種獨特的質(zhì)子泵，在多種動植物中都存在。它能夠水解無機焦 磷酸鹽的磷酸酐鍵，并利用所釋放的能量轉(zhuǎn)運質(zhì)子，產(chǎn)生跨膜的電化學(xué)梯度，發(fā)揮和質(zhì)子泵 ATP酶類似的作用。V-H+-Ppase能使儲存的能量高效轉(zhuǎn)化為H+和/或電轉(zhuǎn)膜梯度，用于多 種不同的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運過程。V-PPases最早被發(fā)現(xiàn)存在于植物和光合細(xì)菌中，近期研宄表明 錐蟲、利什曼原蟲、弓形蟲、惡性瘧原蟲也存在這種酶。值得關(guān)注的是，在這些寄生蟲的動物 宿主中均不存在這種酶類，因此V-PPases作為寄生蟲病潛在的藥物靶點具有重要的研宄 價值。弓形蟲的V-PPases主要分布于酸性鈣體及質(zhì)膜，根據(jù)結(jié)構(gòu)和功能的不同可分為兩 種類型，VP1和VP2。TgVPl需要K+激活其生物學(xué)活性。當(dāng)弓形蟲入侵細(xì)胞時，TgVPl組成 圈狀結(jié)構(gòu)分布于弓形蟲外緣，并隨著弓形蟲的侵入在蟲體內(nèi)迀移。當(dāng)弓形蟲完成侵襲過程 時，TgVPl重新回到弓形蟲的頂端。TgVPl含有17個跨膜域，N端具有信號肽序列，可以指 導(dǎo)TgVPl進(jìn)入弓形蟲的分泌途徑，但具體作用機制尚不明確。有研宄表明弓形蟲焦磷酸酶 活性可抑制弓形蟲在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制。因此，TgVPl有作為潛在的弓形蟲病臨床診斷和治療 革巴標(biāo)的可能，制備TgVP1的抗體具有十分重要的意義，可以為該蛋白功能的研宄奠定基礎(chǔ)， 同時為其作為疾病標(biāo)志物的可行性提供實驗數(shù)據(jù)支持。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種能用于ELISA、western-blot及 免疫熒光檢測的抗弓形蟲蛋白TgVPl的單克隆抗體。
[0004] 為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0005] 本發(fā)明所述的檢測弓形蟲蛋白TgVPl的抗體是用合成TgVPl抗原多肽作為抗原免 疫BALB/c小鼠獲得，并用細(xì)胞融合技術(shù)獲得產(chǎn)生這種抗體的雜交瘤細(xì)胞株1D7,雜交瘤細(xì) 胞分泌的抗體為IgGl陽性，輕鏈為k型。所述抗弓形蟲蛋白TgVPl單克隆抗體雜交瘤1D7， 于2014年12月16日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCCN0:C2014230。
[0006] 本發(fā)明中弓形蟲蛋白TgVPl的氨基酸序列為EPT25031. 1，如SEQIDNO:1所示。
[0007] 本發(fā)明中弓形蟲蛋白TgVPl的抗原多肽序列如SEQIDN0 :2所示。
[0008] 本發(fā)明所述的保藏號為CCTCCN0:C2014230的雜交瘤細(xì)胞株1D7的制備方法是： TgVPl抗原多肽與馬來酰胺活化的匙孔血藍(lán)載體蛋白KLH偶聯(lián)，經(jīng)脫鹽純化后作為免疫原 與佐劑混合免疫BALB/c小鼠，期間進(jìn)行兩次以上免疫，取血清效價大于1:105的BALB/c小 鼠脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞按常規(guī)方法用50%PEG-4000進(jìn)行融合；用含20%小牛血清 的HATRPMI-1640培養(yǎng)基篩選融合細(xì)胞，用TgVPl抗原多肽包被ELISA板，進(jìn)行ELISA篩選； 經(jīng)過多次有限稀釋，最后獲得穩(wěn)定分泌抗TgVPl單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，標(biāo)記為1D7。 應(yīng)用此株雜交瘤細(xì)胞以IX106/只的量注入石蠟預(yù)處理的8-10周齡的BALB/c雌性小鼠腹 腔，飼養(yǎng)觀察10-14天后小鼠腹部膨大時抽取腹水。采用親和色譜法ProteinGSepharose FastFlow純化單克隆抗體，以SDS-PAGE鑒定單克隆抗體的純度，純度達(dá)到90%以上。
[0009] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明特色如下：
[0010] 本發(fā)明以合成的TgVPl抗原多肽包被ELISA板，通過ELISA法檢測純化抗體的活 性，并用此純化抗體對純化的弓形蟲蛋白進(jìn)行Western-blot證明該抗體可以識別TgVPl蛋 白。
[0011] 本發(fā)明將此純化抗體用于進(jìn)行弓形蟲的免疫熒光染色證明其能識別天然的TgVPl 蛋白。此株雜交瘤細(xì)胞分泌的單克隆抗體為進(jìn)一步研宄TgVPl功能奠定基礎(chǔ)，同時為其作 為疾病標(biāo)志物的可行性提供實驗數(shù)據(jù)支持。
[0012] 本發(fā)明的單克隆抗體其免疫原是偶聯(lián)了KLH的合成TgVPl抗原多肽，其肽序列如 SEQIDN0 :2所示，全長29個氨基酸。本發(fā)明的單克隆抗體除了能應(yīng)用于ELISA和Western 檢測變性TgVPl蛋白以外還可以應(yīng)用于細(xì)胞免疫熒光檢測未變性的天然TgVPl蛋白。目前 國內(nèi)外尚無針弓形蟲TgVPl特異性抗體，而本發(fā)明的抗體不僅能與變性蛋白結(jié)合，還能與 具有高級結(jié)構(gòu)的天然蛋白結(jié)合，從而能應(yīng)用于免疫熒光等實驗。本發(fā)明針對TgVPl合成短 肽制備出的單克隆抗體對檢測TgVPl蛋白具有較高的特異性和靈敏度，該抗體的應(yīng)用將為 TgVPl的功能研宄和其作為疾病標(biāo)志物的可行性提供實驗數(shù)據(jù)支持。
【附圖說明】
[0013] 圖1是是本發(fā)明單抗1D7對弓形蟲免疫印跡的結(jié)果，其結(jié)合條帶的分子量約為 85kDa。泳道M:蛋白Marker;泳道1 :上樣為弓形蟲速殖子裂解蛋白；泳道2 :上樣為OFTu 細(xì)胞裂解蛋白。
【具體實施方式】
[0014] 下列實施例旨在舉例說明而不是限制本發(fā)明。
[0015] 實施例1本發(fā)明單克隆抗體的制備和鑒定
[0016] 1、單抗1D7的制備
[0017] 1)弓形蟲TgVPl抗原多肽的設(shè)計、制備及載體偶聯(lián)
[0018] 根據(jù)GenBank上的弓形蟲TgVPl序列（登錄號：EPT25031. 1)獲得弓形蟲TgVPl 蛋白序列，含有816個氨基酸。用TMHMM軟件分析TgVPl蛋白的跨膜域，IEDB軟件分析 TgVPl蛋白免疫原性、親疏水性及表面可及性，結(jié)果表明弓形蟲TgVPl蛋白292-320aa有29 個氨基酸抗原性、親水性及表面可及性較強（圖1)。經(jīng)過上述分析，最終篩選多肽序列為： 292aa-320aa，SEQIDN0:2。該短肽（TgVPl-Pl)及C端偶聯(lián)匙孔血藍(lán)載體蛋白KLH的短肽 (TgVPl-Pl-KLH)由上海吉爾生化公司合成。
[0019] 2)免疫小鼠
[0020] 以合成肽TgVPl-Pl-KLH免疫6-8周齡雌性BALB/c小鼠。
[0021] 第一次免疫：取合成肽TgVPl-Pl-KLH與等體積的Bentonite佐劑混勻后，以每只 50yg/500yL的量腹腔內(nèi)注射BALB/c小鼠；
[0022] 第二次免疫：隔2周后，取合成肽TgVPl-Pl-KLH與等體積的Bentonite佐劑混勻 后，以每只50yg/500yL的量腹腔內(nèi)注射BALB/c小鼠；
[0023] 第三次免疫：再隔2周后，取合成肽TgVPl-Pl-KLH與等體積的Bentonite佐劑混 勻后，以每只50 y g/500 y L的量腹腔注射BALB/c小鼠；第三次免疫10天后小鼠尾靜脈取 血，以合成肽TgVPl-Pl包被，ELISA檢測血清效價，取效價大于1:105的小鼠脾細(xì)胞與骨髓 瘤細(xì)胞進(jìn)行融合；
[0024] Bentonite佐劑使用商品化產(chǎn)品。
[0025] 3)免疫血清效價測定
[0026] 采用間接ELISA法測定免疫血清效價。取50yg合成肽TgVPl-Pl溶解于10ml 0. 05MpH9. 6碳酸鹽緩沖液，包被聚苯乙烯微96孔板，lOOyl/孔，4°C過夜。使用PBS(含 有 0? 05% (V/V)Tween-20)洗板三次，用 10mMPBS含 1 %BSA封閉液 100y1/ 孔，37°C封 閉2h，使用PBS(含有0. 05% (V/V)Tween-20)洗板三次，第三次免疫后10天小鼠尾靜脈采 血，鼠免疫血清用含1 %BSA10mMPBS進(jìn)行10-2~10-8倍稀釋，加入96孔板，100y1/孔 37°Clh，PBS(含有0. 05% (V/V)Tween-20)洗板三次后，加入1 :10000倍稀釋辣根過氧化物 酶標(biāo)記羊抗小鼠IgG(Sigma，INC.)，100y1/孔37°C30mi