清，加入800 μ L Virus holder溶液，反復(fù)凍融3次，0.22Mm濾膜過濾，濾液-20°C保存?zhèn)溆茫?br> 肝臟、腎臟等內(nèi)臟樣品處理方法:
取0.5g樣品，用無菌PBS洗2次，剪碎后加入ImL Virus holder溶液用勻漿器研磨至勻漿狀，反復(fù)凍融3次，4000r/min離心7min后取上清，0.22Mm濾膜過濾，濾液_20°C保存?zhèn)溆茫?br> 步驟二:病毒分咼:
取ImL濾液接種于已鋪滿培養(yǎng)瓶瓶底85%的牛睪丸原代細(xì)胞，370C，5%C02培養(yǎng)箱孵育Ih后棄去毒液；
加7mL細(xì)胞維持液，37 0C，5%C02培養(yǎng)72h后收毒；
反復(fù)凍融3次，然后無菌收集細(xì)胞培養(yǎng)物，從第2代開始接毒600uL，在第3代接種牛睪丸細(xì)胞后的72h可觀察到細(xì)胞病變。
[0025]步驟一中，Virusholder 溶液包含 Tris 0.01 mol/L、NaCl 0.15 mol/L 和 EDTA0.005 mol/L ；
Virus holder溶液的配置方法為:
先稱取Tris放入洗凈的燒杯中，再稱取NaCl放入燒杯中，然后加入EDTA，再加入500mL雙蒸水，攪拌至完全溶解，調(diào)整pH到8.0，配好的溶液用0.22ΜΠ1濾膜過濾后，4°C保存?zhèn)溆谩?br>[0026]配制500 mL Virus holder溶液的方法為:
先稱量0.605g Tris放入洗凈的燒杯中，再稱取4.38g NaCl放入燒杯中，然后加入0.73g EDTA,再加入500 mL雙蒸水，攪拌至完全溶解，調(diào)整PH到8.0，配好的溶液用0.22Mm濾膜過濾后，4°C保存?zhèn)溆谩?br>[0027]步驟二中，牛睪丸原代細(xì)胞的培養(yǎng)液為含有5%犢牛血清的M199培養(yǎng)基，牛睪丸原代細(xì)胞在該培養(yǎng)基中37°C、5%C02培養(yǎng)2天待用。
[0028]步驟二中，細(xì)胞維持液為含有2%犢牛血清的M199培養(yǎng)基。
[0029]實(shí)施例3:
步驟一:材料的處理:
唾液、乳汁樣品的處理方法:
16000r/min離心5min后，取200 μ L上清，加入800 μ L Virus holder溶液，反復(fù)凍融3次，0.22Mm濾膜過濾，濾液-20°C保存?zhèn)溆茫?br> 肝臟、腎臟等內(nèi)臟樣品處理方法:
取0.5g樣品，用無菌PBS洗3次，剪碎后加入ImL Virus holder溶液用勻漿器研磨至勻漿狀，反復(fù)凍融3次，3000r/min離心1min后取上清，0.22Mm濾膜過濾，濾液_20°C保存?zhèn)溆?
步驟二:病毒分咼:
取ImL濾液接種于已鋪滿培養(yǎng)瓶瓶底80%的牛睪丸原代細(xì)胞，370C，5%C02培養(yǎng)箱孵育
1.5h后棄去毒液；
加5mL細(xì)胞維持液，37 0C，5%C02培養(yǎng)72h后收毒；
反復(fù)凍融3次，然后無菌收集細(xì)胞培養(yǎng)物，從第2代開始接毒600uL，在第3代接種牛睪丸細(xì)胞后的72h可觀察到細(xì)胞病變。
[0030]步驟一中，Virusholder 溶液包含 Tris 0.01 mol/L, NaCl 0.15 mol/L 和 EDTA0.005 mol/L ；
Virus holder溶液的配置方法為:
先稱取Tris放入洗凈的燒杯中，再稱取NaCl放入燒杯中，然后加入EDTA，再加入500mL雙蒸水，攪拌至完全溶解，調(diào)整pH到8.0，配好的溶液用0.22ΜΠ1濾膜過濾后，4°C保存?zhèn)溆谩?br>[0031]配制500 mL Virus holder溶液的方法為:
先稱量0.605g Tris放入洗凈的燒杯中，再稱取4.38g NaCl放入燒杯中，然后加入0.73g EDTA,再加入500 mL雙蒸水，攪拌至完全溶解，調(diào)整PH到8.0，配好的溶液用0.22Mm濾膜過濾后，4°C保存?zhèn)溆谩?br>[0032]步驟二中，牛睪丸原代細(xì)胞的培養(yǎng)液為含有5%犢牛血清的M199培養(yǎng)基，牛睪丸原代細(xì)胞在該培養(yǎng)基中37°C、5%C02培養(yǎng)3天待用。
[0033]步驟二中，細(xì)胞維持液為含有2%犢牛血清的M199培養(yǎng)基。
[0034]實(shí)施例4:
步驟一:材料的處理:
唾液、乳汁樣品的處理方法:
14000r/min離心1min后，取200 μ L上清，加入800 μ L Virus holder溶液，反復(fù)凍融3次，0.22Mm濾膜過濾，濾液-20°C保存?zhèn)溆茫?br> 肝臟、腎臟等內(nèi)臟樣品處理方法:
取0.5g樣品，用無菌PBS洗3次，剪碎后加入ImL Virus holder溶液用勻漿器研磨至勻漿狀，反復(fù)凍融3次，3000r/min離心1min后取上清，0.22Mm濾膜過濾，濾液_20°C保存?zhèn)溆?
步驟二:病毒分咼: 取ImL濾液接種于已鋪滿培養(yǎng)瓶瓶底80%的牛睪丸原代細(xì)胞，370C，5%C02培養(yǎng)箱孵育1-1.5h后棄去毒液；
加1mL細(xì)胞維持液，370C，5%C02培養(yǎng)72h后收毒；
反復(fù)凍融3次，然后無菌收集細(xì)胞培養(yǎng)物，從第2代開始接毒600uL，在第3代接種牛睪丸細(xì)胞后的72h可觀察到細(xì)胞病變。
[0035]步驟一中，Virusholder 溶液包含 Tris 0.01 mol/L、NaCl 0.15 mol/L 和 EDTA0.005 mol/L ；
Virus holder溶液的配置方法為:
先稱取Tris放入洗凈的燒杯中，再稱取NaCl放入燒杯中，然后加入EDTA，再加入500mL雙蒸水，攪拌至完全溶解，調(diào)整pH到8.0，配好的溶液用0.22ΜΠ1濾膜過濾后，4°C保存?zhèn)溆谩?br>[0036]配制500 mL Virus holder溶液的方法為:
先稱量0.605g Tris放入洗凈的燒杯中，再稱取4.38g NaCl放入燒杯中，然后加入0.73g EDTA,再加入500 mL雙蒸水，攪拌至完全溶解，調(diào)整PH到8.0，配好的溶液用0.22Mm濾膜過濾后，4°C保存?zhèn)溆谩?br>[0037]步驟二中，牛睪丸原代細(xì)胞的培養(yǎng)液為含有5%犢牛血清的M199培養(yǎng)基，牛睪丸原代細(xì)胞在該培養(yǎng)基中37°C、5%C02培養(yǎng)2-3天待用。
[0038]步驟二中，細(xì)胞維持液為含有2%犢牛血清的M199培養(yǎng)基。
[0039]本發(fā)明各取羊口瘡病原陽性肝腎樣品20份、唾液樣5份、乳樣5份，都成功分離出羊口瘡病毒，分尚率100%。
[0040]本發(fā)明的內(nèi)容不限于實(shí)施例所列舉，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通過閱讀本發(fā)明說明書而對本發(fā)明技術(shù)方案采取的任何等效的變換，均為本發(fā)明的權(quán)利要求所涵蓋。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.羊口瘡病毒低含量樣品的病毒分離方法，其特征在于: 由以下步驟實(shí)現(xiàn): 步驟一:材料的處理: 唾液、乳汁樣品的處理方法: 12000 ?16000r/min 離心 5 ?1min 后，取 200 μ L 上清，加入 800 μ L Virus holder溶液，反復(fù)凍融3次，0.22Mm濾膜過濾，濾液-20°C保存?zhèn)溆茫? 內(nèi)臟樣品處理方法: 取0.5g樣品，用無菌PBS洗2?3次，剪碎后加入ImL Virus holder溶液用勻漿器研磨至勾楽狀，反復(fù)凍融3次，3000?5000r/min離心5?1min后取上清，0.22Mm濾膜過濾，濾液-20 °C保存?zhèn)溆茫? 步驟二:病毒分咼: 取ImL濾液接種于已鋪滿培養(yǎng)瓶瓶底80%?90%的牛睪丸原代細(xì)胞，37°C，5%C02培養(yǎng)箱孵育I?1.5h后棄去毒液； 加5?1mL細(xì)胞維持液，370C，5%C02培養(yǎng)72h后收毒； 反復(fù)凍融3次，然后無菌收集細(xì)胞培養(yǎng)物，從第2代開始接毒600uL，在第3代接種牛睪丸細(xì)胞后的72h可觀察到細(xì)胞病變。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的羊口瘡病毒低含量樣品的病毒分離方法，其特征在于: 步驟一中，Virus holder 溶液包含Tris 0.01 mol/L、NaCl 0.15 mol/L和EDTA 0.005mol/L ； Virus holder溶液的配置方法為: 先稱取Tris放入洗凈的燒杯中，再稱取NaCl放入燒杯中，然后加入EDTA，再加入500mL雙蒸水，攪拌至完全溶解，調(diào)整pH到8.0，配好的溶液用0.22ΜΠ1濾膜過濾后，4°C保存?zhèn)溆谩?br>3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的羊口瘡病毒低含量樣品的病毒分離方法，其特征在于: 步驟二中，牛睪丸原代細(xì)胞的培養(yǎng)液為含有5%犢牛血清的M199培養(yǎng)基，牛睪丸原代細(xì)胞在該培養(yǎng)基中37°C、5%C02培養(yǎng)2?3天待用。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的羊口瘡病毒低含量樣品的病毒分離方法，其特征在于: 步驟二中，細(xì)胞維持液為含有2%犢牛血清的M199培養(yǎng)基。
【專利摘要】本發(fā)明涉及羊口瘡病毒低含量樣品的病毒分離方法。傳統(tǒng)的羊口瘡病毒都是從結(jié)痂和患病羊的口唇皮屑中分離的，分離周期長，需要盲傳5代后才會有病變，同時(shí)，病料來源范圍小，限制的羊口瘡病毒的研究工作。本發(fā)明使用特有的Virus holder 溶液對唾液、乳汁、內(nèi)臟等樣品進(jìn)行離心過濾處理后，接種于牛睪丸原代細(xì)胞中培養(yǎng)后棄去毒液；加細(xì)胞維持液培養(yǎng)后收毒；反復(fù)凍融收集細(xì)胞培養(yǎng)物，從第3代接種牛睪丸細(xì)胞后的72h可觀察到細(xì)胞病變。本發(fā)明使用特有的Virus holder溶液處理樣品，能夠從病毒含量極低的樣品中分離羊口瘡病毒，取材范圍大，病毒分離周期短，穩(wěn)定性高，能夠很好的保持病毒的完整性和活性。
【IPC分類】C12N7-00, C12R1-93
【公開號】CN104745539
【申請?zhí)枴緾N201510152702
【發(fā)明人】陳德坤, 周銘, 劉方, 劉鶴媛, 高洋, 趙燕青
【申請人】西北農(nóng)林科技大學(xué)
【公開日】2015年7月1日
【申請日】2015年4月2日