利用talen敲除人乳頭瘤病毒e6e7癌基因的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因治療領(lǐng)域，本發(fā)明公開了包括針對高危型人乳頭瘤病毒E6E7癌 基因序列構(gòu)建靶向的TALEN質(zhì)粒的方法，并利用TALEN靶向敲除高危型人乳頭瘤病毒E6E7 癌基因的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 宮頸癌是世界女性第三大常見的惡性腫瘤，也是第四大致死性惡性腫瘤。據(jù)統(tǒng)計， 2008年世界范圍內(nèi)新發(fā)病例529, 800例，占所有腫瘤總數(shù)的9%，其中死亡病例275, 100， 占女性腫瘤患者總死亡人數(shù)的8% ;這些新發(fā)病例和死亡患者在發(fā)展中國家占據(jù)85%以上 (0〇81316￡了等，柳葉刀雜志，2013,382:889-899;>11^1六等，〇六：3〇311〇61']_〇111'仙1;1^〇『 clinicians雜志，2011，61 :69_90)〇
[0003] 高危型人乳頭狀瘤病毒（HumanPapillomavirus，HPV)，特別是HPV16和HPV18兩 種高危亞型，是宮頸癌發(fā)生發(fā)展的重要致病因素。HPV病毒感染宿主后，表達E6和E7兩種 早期癌蛋白。E6蛋白在細胞內(nèi)與E6相關(guān)蛋白（E6_associatedprotein，E6AP)和抑癌蛋 白p53形成三聚體復(fù)合物，誘導(dǎo)p53蛋白的泛素化并經(jīng)過蛋白酶體降解；此外，E6也可以通 過直接與p53結(jié)合干擾其DNA結(jié)合能力而阻斷p53的轉(zhuǎn)錄。p53功能的缺失或蛋白的降解 使得細胞逃逸正常的細胞凋亡。E7蛋白則抑制另一個抑癌蛋白RB1的活性，從而激活E2F 轉(zhuǎn)錄因子家族，使得細胞的增殖能力增強，并能逃脫細胞周期對細胞生存的影響。在E6和 E7蛋白的共同作用下，受感染的細胞增殖能力增強，不受細胞周期的控制，最終獲得了腫瘤 細胞所具有的惡性表型。因此，E6和E7成為HPV感染相關(guān)疾病特別是宮頸癌的基因治療 的最重要靶標。
[0004] 文獻報道利用靶向于HPVE6或E7的反義RNA技術(shù)（Hamada，K等，1996， Gynecologiconcology. 63 :219_227)、Ribozymes(核酶）技術(shù)（He，Y等，1993，F(xiàn)EBS letters. 322 :21-24)或小干擾RNA(siRNA)技術(shù)（司馬妮等，2008,Apoptosis. 13 : 273-281 ;王薇等，2010,Cancerletter. 291 :67-75)等基因治療途徑均能在一定程度上抑 制E6或E7癌蛋白的表達，并在一定程度上抑制甚至逆轉(zhuǎn)細胞的惡性表型，體現(xiàn)出一定的臨 床應(yīng)用價值。但是，反義RNA技術(shù)、核酶技術(shù)和小干擾RNA技術(shù)等最大的缺陷在于這些途徑 只能從RNA水平上影響目的蛋白的翻譯，并不影響DNA水平上的基因表達，也就是說，沒有 從根本上解決問題。除此之外，這類基因治療途徑使用的RNA本身易降解，加之由此造成的 給藥方式的缺陷又進一步限制了其在體內(nèi)應(yīng)用的潛力（Shillitoe，E.J，2006,Cancergene therapy. 13 :445-450)。雖然有研宄應(yīng)用病毒載體等攜帶siRNA能有效的抑制E6或E7的 表達，但是病毒載體本身的安全性限制了其在體內(nèi)的應(yīng)用價值。
[0005]TALEN(transcriptionactivator-likeeffectornucleases，轉(zhuǎn)錄激活子樣效 應(yīng)因子核酸酶）技術(shù)是一種新興的靶向基因修飾的技術(shù)。TALEs最初來源于植物病原菌 Xanthomonas，Xanthomonas感染植物后，利用TALEs進入細胞核，與效應(yīng)因子特異性的 DNA序列相結(jié)合，調(diào)芐基因轉(zhuǎn)錄表達。TALEs的結(jié)合序列是有一系列的串聯(lián)重復(fù)的33-35 個氨基酸序列組成的基序。每個重復(fù)序列中僅第12、13位氨基酸不同（r印eatvariable de-residue，RVD，重復(fù)可變雙殘基），不同的RVD能特異性的識別不同的堿基對并能與之 結(jié)合。在此基礎(chǔ)上，連接上非特異性的核酸內(nèi)切酶FokI，即可組裝成TALENs。TALEs特異 性的結(jié)合靶序列，F(xiàn)okI二聚體化后切割DNA序列，產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂（DNAdouble-strand breaks，DSBs)。DSB的產(chǎn)生立即啟動宿主細胞的自我修復(fù)機制。主要的修復(fù)機制有兩 種：同源重組（homologousrecombination，HR)和非同源末端連接（non-homologousend joining，NHEJ)(Chapman，JR等，2012，Molecularcell.47:497_510)。同源重組可以利用 以另一條姐妹染色單體或其他的DNA模板進行修復(fù)，是一種高保真的修復(fù)方式；非同源末 端連接是真核生物細胞在不依賴DNA同源序列的條件下，直接將兩個DNA斷端連接在一起， 這種修復(fù)方式雖然能避免DNA斷裂造成的DNA降解對細胞生存的影響，但是極易在斷裂點 處引入小片段的基因插入或缺失，進而造成框移突變，最終下調(diào)基因的功能。而在哺乳動物 細胞中，非同源末端連接修復(fù)方式占據(jù)著主導(dǎo)作用。因此，應(yīng)用TALENs，即可通過在特異的 DNA位點上誘導(dǎo)產(chǎn)生DSB，再借助細胞利用NHEJ方式修復(fù)DSB時造成框移突變，最終達到基 因敲除的目的（圖1)。
[0006]TALEN技術(shù)發(fā)展迅速，在TomasCermak等的工作基礎(chǔ)上，TALE模塊已經(jīng)實現(xiàn) 商品化，每個模塊都只能特異性的識別某一個核酸堿基（CermakT等，Nucleicacids research，2011，39 :pp.e82)。因此，為了獲得能特異性識別某一特定核酸序列的TALE， 只需要按照給定核酸序列在TALEN在線設(shè)計工具（https://tale-nt.cac.Cornell,edu/ node/add/talen/)上找出對應(yīng)的TALE模版，即可快速高效的構(gòu)建出目的TALEN對。切割 效率高、特異性高、構(gòu)建迅速并且構(gòu)建成本低使得TALEN迅速成為新型的基因修飾技術(shù)。 目前TALENs已在各種物種實現(xiàn)了基因修飾中，如水稻（LiT等，Naturebiotechnology， 2012, 30 :390_392)、酵母（AouidaM等，Currentgenetics，2014,60 :61_74)、果幡（Takasu Y等，Methods，2014,69 :46_57)、家香（WangF等，Moleculargeneticsandgenomics: MGG，2013, 288:683-690)、斑馬魚（ZuY等，NatureMethods，2013,10:329-331;XiaoA等， Nucleicacidsresearch，2013,41 :el41)、小鼠（WefersB等，Natureprotocols，2013,8: 2355-2379，WangH等，Naturebiotechnology，2013, 31 :530_532)、大鼠（PoncedeLeon 等，PloSone，2014,9 :e88146)、猴（LiuH等，Cellstemcell，2014,14:323-328)以及人 類體細胞OingQ等，Cellstemcell，2013,12:238-251)等。
[0007] 本發(fā)明利用構(gòu)建的靶向高危型HPVE6E7癌基因的TALEN表達質(zhì)粒，通過將表達質(zhì) 粒轉(zhuǎn)染到細胞中，特異性的誘導(dǎo)相應(yīng)亞型HPV陽性細胞的增殖抑制和細胞凋亡，體內(nèi)研宄 結(jié)果證實在動物模型內(nèi)應(yīng)用靶向HPV16E7的TALEN可以有效的抑制皮下瘤的生長。因此， 靶向高危型HPVE6E7的TALEN具有重要的臨床應(yīng)用價值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的是提供一種利用TALENs技術(shù)敲除高危型人乳頭瘤病毒E6E7基因的 應(yīng)用方法。
[0009] 本發(fā)明中所述的高危型人乳頭瘤病毒包括但不限于HPV16和HPV18兩種最常見的 HPV亞型。
[0010] 為了實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明采取了如下技術(shù)方案：
[0011] -對針對高危型HPVE6E7基因序列的轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子核酸酶TALENs，能 特異性的高效識別并切割高危型HPVE6E7基因序列；
[0012] 所述的轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子核酸酶TALENs由識別高危型HPVE6E7基因序列的 模塊TAL-HPV-F和TAL-HPV-R組成；
[0013] 所述的TAL-HPV-F，其特征在于，由能識別HPVE6E7序列的TAL-HPV-F識別結(jié)構(gòu) 域與人工優(yōu)化的DNA切割域FokI融合而成；所述的TAL-HPV-R，其特征在于，由能識別HPV E6E7序列的TAL-HPV-R識別結(jié)構(gòu)域與人工優(yōu)化的DNA切割域FokI融合而成；
[0014] 本發(fā)明提供上述靶向高危型HPVE6E7基因的定點修飾系統(tǒng)的制備方法，包括以下 步驟：
[0015] 以下步驟以高危型HPV亞型HPV16和HPV18為例，但不限于這兩種亞型。
[0016] 1)根據(jù)高危型人乳頭瘤病毒E6E7基因序列，設(shè)計TALEN