一種重組鹵醇脫鹵酶、突變體、工程菌及其應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種鹵醇脫鹵酶、其基因及突變體，含有該基因及突變體的重組表達 載體及重組菌，利用重組菌制備重組酶的方法，以及該重組鹵醇脫鹵酶制備環(huán)氧化物、手性 環(huán)氧化物、0 -取代醇的方法。 (二）
【背景技術】
[0002] 鹵醇脫鹵酶，也叫鹵醇-鹵化氫裂解酶，通過分子內親核取代機制催化芳香族或 者脂肪族鄰鹵醇轉化為環(huán)氧化物和鹵化氫。鹵醇脫鹵酶不但可以催化碳-鹵鍵的斷裂進 行脫鹵反應，也可以高選擇性地催化接受除了鹵離子以外的一系列非自然親核試劑，如N3' N02'Cf等所介導的環(huán)氧化物開環(huán)反應。鹵醇脫鹵酶主要通過蛋白結構中保守的絲氨酸與 底物羥基氧原子之間形成氫鍵，穩(wěn)定與底物結合，通過精氨酸降低酪氨酸的pKa值，酪氨酸 從底物上的氧原子作為親核試劑，進攻鄰位鹵素取代的碳原子，進而釋放鹵離子，形成環(huán)氧 化物。鹵醇脫鹵酶介導的生物催化反應，優(yōu)勢主要體現在：1.酶催化反應條件溫和；2.酶催 化手性選擇高。3.酶催化轉化率高
[0003] 鹵醇脫鹵酶可以廣泛應用于合成環(huán)氧化物以及取代醇。其中疊氮化醇、氰取 代醇以及硝基醇是合成氨基醇的前體；手性氨基醇在生物制藥領域是一類很重要的化合 物，可用來合成多種生物活性物質。異硫氰酸取代醇和噁唑烷酮在農用化學試劑、醫(yī)藥和 高分子化學領域中有著廣泛應用。鹵醇脫鹵酶更已成功應用于他汀類藥物關鍵手性中間體 (R) -4-氰基-3-羥基丁酸乙酯的合成。
[0004] 手性環(huán)氧氯丙烷在醫(yī)藥、農藥、化工、材料等領域應用廣泛。隨著手性藥物行業(yè)的 發(fā)展，使得手性環(huán)氧氯丙烷作為一種重要醫(yī)藥中間體的地位更加突出。目前，合成手性環(huán)氧 氯丙烷主要有化學法和生物法拆分兩大類。生物法拆分法具有反應條件溫和、環(huán)境友好的 優(yōu)點。但是生物拆分法獲得的手性環(huán)氧氯丙烷的最高收率只有50%。利用鹵醇脫鹵酶直 接不對稱脫鹵合成手性環(huán)氧氯丙烷，其理論收率可以達到100%，原子經濟效益高，具有潛 在的工業(yè)應用前景。但是利用鹵醇脫鹵酶直接不對稱脫鹵合成手性環(huán)氧氯丙烷的文獻較 少。Tetsuji等利用來源于Corynebacteriumsp.N-1074 中的HheB催化 5mM1，3_ 二氯丙 醇生成（R)_環(huán)氧氯丙烷。反應初始階段（R)_環(huán)氧氯丙烷的ee值最大可達90%，但隨著 反應的進行，ee值慢慢下降直至最終為零。LutjeSpelberg等利用來源于Agrobacterium radiobacterAD1的鹵醇脫鹵酶HheC催化1,3-二氯丙醇或2,3-二氯-1-丙醇合成環(huán)氧 氯丙烷，其ee值小于5%。本課題組也從運動替斯崔納菌中克隆得到了新的鹵醇脫鹵酶，催 化1，3-DCP不對稱脫鹵合成（S)-環(huán)氧氯丙烷，但是ee值最高只有60 %，而且隨著反應的進 行，ee值同樣在下降（CN104263713A) 〇
[0005] 近年來，已從多種微生物中發(fā)現了鹵醇脫鹵酶，部分鹵醇脫鹵酶的基因已被克隆 并在大腸桿菌中表達，獲得產酶活力較高的基因工程菌，并應用于催化合成環(huán)氧化物及 0-取代醇。目前已知的鹵醇脫鹵酶，僅有8種已成功在大腸桿菌中表達，并進行了催化特 性的研宄。但是目前發(fā)現的鹵醇脫鹵酶，催化特性優(yōu)異的鹵醇脫鹵酶不易獲得，使得大多數 不對稱脫鹵反應，收率低，產物ee值低，無法真正應用于工業(yè)生產。因此，開發(fā)新型且具有 應用潛力的鹵醇脫鹵酶一直是生物脫鹵和生物開環(huán)的重點研宄方向之一。隨著DNA測序技 術的進步，急劇增加的生物信息為新酶的開發(fā)帶來了前所未有的機遇，近年來基因數據挖 掘技術已成為快速開發(fā)新酶的有力手段。利用已獲得的鹵醇脫鹵酶序列作為探針，在整個 基因數據庫中挖掘同源序列，獲得候選酶基因，利用蛋白質工程手段可以進一步改造所獲 得的天然酶，從而得到具有所需催化特性的突變酶。通過隨機突變、定點突變等蛋白質工程 的手段對鹵醇脫鹵酶進行立體選擇性的改造，提高其對應選擇性，將具有較高的應用價值。 (三）
【發(fā)明內容】

[0006] 本發(fā)明所要解決的問題是，針對之前報道的鹵醇脫鹵酶催化1，3-二氯丙醇不對 稱脫鹵合成手性環(huán)氧氯丙烷ee值偏低的問題，提供一種鹵醇脫鹵酶及其編碼基因、鹵醇脫 鹵酶突變體及其編碼基因，含有所述編碼基因的重組表達載體和重組工程菌，以及將該鹵 醇脫鹵酶、突變體、表達該鹵醇脫鹵酶或突變體的重組工程菌作為催化劑催化1，3-二氯丙 醇，制備光學純（S)_環(huán)氧氯丙烷。本發(fā)明同時還提供了該重組鹵醇脫鹵酶和突變體在催化 其它鹵代醇生物脫鹵或不對稱拆分環(huán)氧化物合成手性環(huán)氧化物和0 _取代醇中的應用。
[0007] 本發(fā)明采用的技術方案是：
[0008] 本發(fā)明提供一種來源于Sneathiella glossodoripedis的重組齒醇脫齒酶，所述 重組鹵醇脫鹵酶的氨基酸序列如SEQIDNo. 2所示，所述重組鹵醇脫鹵酶的編碼基因的核 苷酸序列為SEQIDNo.1所示。
[0009] 本發(fā)明的鹵醇脫鹵酶基因具體制備方法為：以來源于運動替斯崔納菌（Tistrella mobilisZJB1405，CN104263713A)的鹵醇脫鹵酶作為探針，在NCBI數據庫搜索同源 氨基酸序列，發(fā)現該序列與Genbank中收錄的預測為Sneathiellaglossodoripedis hypotheticalprotein(GenbankNo.WP_037493663)的同源性為 42%，通過序列比對發(fā)現 該hypotheticalprotein具有與鹵醇脫鹵酶相同的催化三聯體和一些關鍵的保守序列，推 測該水解蛋白為疑似鹵醇脫鹵酶。因NCBI未公布該hypotheticalprotein的基因序列， 根據其氨基酸序列，以及在大腸桿菌異源表達的密碼子偏好性，設計合成基因，交送上海旭 冠生物科技發(fā)展有限公司合成。堿基序列如SEQIDNo. 1所示的基因，命名為HHDHSg，全長 732bp，氨基酸編碼序列從第1個堿基至第729個堿基止，起始密碼子為ATG，終止密碼子為 TAA，其編碼的氨基酸序列如SEQIDNo. 2所示。
[0010] 本發(fā)明涉及一種所述重組鹵醇脫鹵酶編碼基因構建的重組載體。其可通過本領 域常規(guī)方法將本發(fā)明的重組鹵醇脫鹵酶基因連接于各種表達載體上構建而成。所述的載 體可為本領域常規(guī)的各種載體，如市售的質粒、粘粒、噬菌體或病毒載體等，優(yōu)選質粒為 pET28a(b)。較佳的，可通過下述方法制得本發(fā)明的重組表達載體：設計合成基因并在兩端 引入XbaI和XhoI酶切位點，交由上海旭冠生物技術有限公司合成，之后將合成基因與表 達載體pET28b用限制性內切酶XbaI和XhoI雙酶切，形成互補的粘性末端，再經T4DNA 連接酶連接，形成含有本發(fā)明的鹵醇脫鹵酶基因的重組表達載體pET28b-HHDHSg。
[0011] 本發(fā)明涉及一種所述重組載體構建的重組基因工程菌。其可通過將本發(fā)明的重組 表達載體轉化至宿主微生物中制得。所述的宿主微生物可為本領域常規(guī)的各種宿主微生 物，只要能滿足重組表達載體可穩(wěn)定的自行復制，且所攜帶的本發(fā)明的重組鹵醇脫鹵酶基 因可被有效表達即可。本發(fā)明優(yōu)選大腸桿菌，更優(yōu)選大腸埃希菌（E.coli)BL21(DE3)。將前 述重組表達質粒pET28b-HHDHTm轉化至（E.coli)BL21(DE3)中，即可得本發(fā)明優(yōu)選的基因工 程菌株，即E.coliBL21 (DE3)/pET28b-HHDHSg。
[0012] 本發(fā)明還涉及重組鹵醇脫鹵酶的制備方法，其中包括如下步驟：將所述含重組鹵 醇脫鹵酶基因的重組載體轉化至大腸桿菌中，獲得的重組基因工程菌進行誘導培養(yǎng)，培養(yǎng) 液分離得到含有重組鹵醇脫鹵酶的菌體細胞。培養(yǎng)本發(fā)明的重組工程菌，獲得重組表達鹵 醇脫齒酶，所述的培養(yǎng)重組工程菌所用的培養(yǎng)基可為本領域任何可使重組工程菌生長并產 生本發(fā)明的鹵醇脫鹵酶的培養(yǎng)基，優(yōu)選LB培養(yǎng)基：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl10g/L， 溶劑為去離子水，pH7.0。培養(yǎng)方法和培養(yǎng)條件沒有特殊的限制，可以根據宿主類型和培養(yǎng) 方法等因素的不同按本領域普通知識進行適當的選擇，只要使重組工程菌能夠生長并產生 本發(fā)明所述的鹵醇脫鹵酶即可。其他培養(yǎng)轉化體具體操作均可按本領域常規(guī)操作進行，優(yōu) 選下述方法：將本發(fā)明涉及的重組大腸桿菌重組表達轉化體接種至含有終濃度50mg/L卡 那霉素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，當培養(yǎng)液的光密度0D_達到0. 8時，在終濃度為0. 2mM的異丙 基-0-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG)的誘導下，高效表達本發(fā)明的重組鹵醇脫鹵酶。
[0013] 本發(fā)明還涉及一種所述重組鹵醇脫鹵酶在催化鹵代醇制備手性環(huán)氧化物中的應 用，所述的應用為：以含重組鹵醇脫鹵酶基因的工程菌經發(fā)酵培養(yǎng)獲得的濕菌體為催化劑， 以鹵代醇為底物，在pH值為7~11(優(yōu)選8-10)的緩沖液中，于10-50°C(優(yōu)選20-40°C， 更優(yōu)選35°C)、150r/min條件下反應，反應結束后，將反應液分離純化，獲得手性環(huán)氧化物； 所述鹵代醇為1，3-二氯丙醇、1，3-二溴丙醇、2-氯-1-苯乙醇或2, 3-二溴丙醇，所述濕菌 體的用量為1~50g/L緩