一種高溫木聚糖酶和一種高溫木糖苷酶的基因及其蛋白表達和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程和生物質(zhì)利用領(lǐng)域，具體涉及一種高溫木聚糖酶基因和一種 高溫木糖苷酶基因及其蛋白表達與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】：
[0002] 半纖維素是自然界中數(shù)量最大、最重要的可再生利用的生物質(zhì)之一。木聚糖是半 纖維素中最主要的組分。木聚糖結(jié)構(gòu)復(fù)雜，主鏈由通過0-1，4-糖苷鍵連接的吡喃木糖 組成，并包含葡萄糖醛酸基、乙?；琣-L-呋喃型阿拉伯糖基等側(cè)鏈。木聚糖及其酶解產(chǎn) 物在食品、飲料、飼料、醫(yī)藥、化工、服裝和造紙等領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用價值（M.P〇lizeli，A. Rizzatti，R.Montietal.2005)。盡管天然木聚糖的酶解得到廣泛的重視，但酶協(xié)同作用 低、穩(wěn)定性差等因素仍然限制了其應(yīng)用。本發(fā)明涉及的高溫厭氧菌C.owensensis0L能夠 在高溫環(huán)境下高效利用天然半纖維素為碳源（S.Blumer-Schuette,D.Lewis,R.Kellyet al. 2010)。本發(fā)明從C.owensensis0L中獲得0 -1，4-木聚糖酶和0 -1，4-木糖苷酶基因， 并在進行大量重組表達。0 -1，4-木聚糖酶能夠具有在高溫條件下（75°C)將天然半纖維素 轉(zhuǎn)化低聚木糖，0 -1，4-木聚糖酶和0 -1，4-木糖苷酶能夠協(xié)同作用將天然木聚糖完全轉(zhuǎn) 化成木糖。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 發(fā)明目的：
[0004] 本發(fā)明的目的是彌補現(xiàn)有木聚糖降解技術(shù)的不足，提供一種高溫木聚糖酶和一種 高溫木糖苷酶的基因，包含基因的重組載體和重組工程菌，以及兩種酶的蛋白表達和應(yīng)用。 具體包括如下：
[0005] 1、一種高溫P-1，4-木聚糖酶CoXylanaseA的基因，其基因序列如SEQIDNO. 1 所不，其表達的蛋白的氣基酸序列如SEQIDNO. 2所不。
[0006] 2、一種高溫@-1，4-木糖苷酶(：〇乂71〇81(1&86 4的基因，其基因序列如5￡0 10 NO. 3所不，其表達的蛋白的氣基酸序列如SEQIDNO. 4所不。
[0007] 3、本發(fā)明提供包含上述木聚糖酶基因的重組載體pET-28b-XylanaSeA和包含上 述木糖苷酶基因的重組載體pET-28b-XylosidaseA。
[0008] 4、本發(fā)明提供包含上述木聚糖酶Co Xylanase A和木糖苷酶Co Xylosidase A基 因及重組載體的重組菌，所述菌株為大腸桿菌Escherichia coli BL21 (DE3)。
[0009] 5、本發(fā)明提供制備上述木聚糖酶Co Xylanase A和木糖苷酶Co Xylosidase A表 達和純化的方法。
[0010]6、本發(fā)明提供上述高溫木聚糖酶Co Xylanase A和木糖苷酶Co Xylosidase A在 酶解天然木聚糖和木質(zhì)纖維素原料上的單獨和協(xié)同應(yīng)用，優(yōu)選其在水解櫸木木聚糖及其在 制備低聚木糖和木糖中的應(yīng)用。
[0011] 技術(shù)方案：
[0012] 為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：
[0013] (1)高溫木聚糖酶CoXylanaseA和木糖苷酶CoXylosidaseA基因重組載體和 重組工程菌的構(gòu)建。
[0014] 提取熱解纖維素菌C.owensensis的基因組，設(shè)計引物分別PCR擴增木聚糖酶Co XylanaseA和木糖苷酶CoXylosidaseA的基因，再酶切連接到載體pET_28b上，轉(zhuǎn)化大腸 桿菌ToplO感受態(tài)細胞，篩選并通過測序鑒定陽性重組載體，提取重組載體質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸 桿菌BL21 (DE3)感受態(tài)細胞，獲得還有重組載體的重組工程菌。
[0015] (2)上述高溫木聚糖酶CoXylanaseA和木糖苷酶CoXylosidaseA的蛋白純化 和酶學(xué)活性測定。
[0016]將獲得的重組工程菌轉(zhuǎn)接培養(yǎng)，IPTG誘導(dǎo)酶蛋白表達。通過超聲波破碎細胞，高 速離心和Ni-NTAs印harose4B親和層析分離純化；然后通過SDS-PAGE電泳和分子篩鑒定 蛋白分子大小和聚合態(tài)，其中高溫木聚糖酶CoXylanaseA以單體形式存在，高溫木糖苷酶 CoXylosidaseA存在單體和聚體形式；最后濃縮，測定蛋白濃度，分析蛋白的酶學(xué)性質(zhì)。
[0017] (3)上述高溫木聚糖酶CoXylanaseA和木糖苷酶CoXylosidaseA對天然木聚 糖的應(yīng)用。
[0018] 稱取并配制天然櫸木木聚糖溶液，將溶液分為四組，一組為對照，一組加高溫木聚 糖酶Co Xylanase A，一組加高溫木糖苷酶Co Xylosidase A，一組合用上述兩種酶，分別在 最適溫度和最適pH范圍內(nèi)作用，然后取反應(yīng)液，用薄層層析法定性分析天然木聚糖水解后 成分，并用對羥基苯甲酸酰肼（P_hydroxybenzoic acid hydrazide，PAHBAH)法測定還原糖 含量。有益效果：為克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明從高溫噬厭氧菌C. owensensis的基因組 中獲得一種高溫木聚糖酶Co Xylanase A和一種高溫木糖苷酶Co Xylosidase A的基因，并 通過克隆表達獲得相關(guān)酶蛋白。高溫木聚糖酶Co Xylanase A最適溫度為75°C，在55-85°C 范圍內(nèi)保持較高活性，最適pH值為7. 0,在pH5. 5-8. 5范圍內(nèi)保持較高活性。高溫木糖苷酶 Co Xylosidase A最適溫度為75°C，在60-85°C范圍內(nèi)保持較高活性，最適pH值為5.0,在 pH4. 5-6. 0范圍內(nèi)保持較高活性。實驗證明高溫木聚糖Co Xylanase A能將天然木聚糖有 效降解為低聚木糖和少量木糖，而聯(lián)合使用高溫木糖苷酶Co Xylosidase A能顯著提高木 糖含量。兩種酶的單獨或聯(lián)合作用具有潛在的工業(yè)應(yīng)用價值。
【附圖說明】
[0019] 圖1 :高溫木聚糖酶CoXylanaseA和高溫木糖苷酶CoXylosidaseA表達的 SDS-PAGE分析
[0020] 其中：A高溫木聚糖酶CoXylanaseA表達的SDS-PAGE分析（M為蛋白分子量標(biāo) 準(zhǔn)）
[0021]B高溫木糖苷酶CoXylosidaseA表達的SDS-PAGE分析(M為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)）
[0022] 圖2:高溫木聚糖酶Co Xylanase A和高溫木糖苷酶Co Xylosidase A的 Superdex200層析和SDS-PAGE電泳圖
[0023] 其中：A高溫木聚糖酶CoXylanaseA
[0024]B高溫木糖苷酶CoXylosidaseA
[0025] 圖3 :溫度和pH對高溫木聚糖酶CoXylanaseA活性的影響
[0026] 其中：A為溫度對高溫木聚糖酶CoXylanaseA活性的影響
[0027]B為pH對高溫木聚糖酶CoXylanaseA活性的影響
[0028] 圖4 :溫度和pH對高溫木糖苷酶CoXylosidaseA活性的影響
[0029] 其中：A為溫度對高溫木聚糖酶CoXylanaseA活性的影響
[0030]B為pH對高溫木聚糖酶CoXylanaseA活性的影響
[0031] 圖5:高溫木聚糖酶Co Xylanase A和高溫木糖苷酶Co Xylosidase A協(xié)同酶解 櫸木木聚糖的薄層層析
[0032]其中：1 標(biāo)樣（Xylose:Xl;Xylobiose:X2;Xylotriose:X3;Xylotetraose:X4) ;2 棒 木木聚
[0033] 糖；3棒木木聚糖+CoXylanaseA;4棒木木聚糖+CoXylosidaseA;5棒木木聚 糖
[0034]+CoXylanaseA+CoXylosidaseA)
【具體實施方式】
[0035] 實施例1 :高溫木聚糖酶CoXylanaseA和高溫木糖苷酶CoXylosidaseA重組 工程菌株的構(gòu)建
[0036] 細菌基因組DNA的提?。?br>[0037] 在75°C，厭氧環(huán)境下培養(yǎng)C.owensensis菌，用細菌基因組DNA提取試劑盒提取培 養(yǎng)細菌的基因組DNA，-20°C凍存?zhèn)溆谩?br>[0038]PCR引物設(shè)計：
[0039] 根據(jù)公開的C.owensensis基因組序列信息，預(yù)測木聚糖酶和木糖苷酶的基因，設(shè) 計克隆所用的PCR引物。其中用于擴增高溫木聚糖酶CoXylanaseA基因的引物如下：
[0040]MI13003 5' -GGAATTCCATATGAGTGAATATCAAGATAAAAC-3'
[0041]MI13004 5' -CCGCTCGAGTTAAAAATTAACAATCCTGAAAAATG-3'
[0042] 用于擴增高溫木糖苷酶CoXylosidaseA基因的引物如下：
[0043]MI13017 5' -GCCGCGCGGCAGCATGAAAATAGAACTTTAC-3'
[0044]MI13018 5' -GCGGCCGCAAGCGTTTACTCAGTTTTTATCG-3'
[0045] 用于連接CoXylosidaseA基因的載體引物如下：
[0046]pET-28b-vector-F5，-CGCTTGCGGCCGCACTCG-3'
[0047]pET-28b-vector-R5' -TGCTGCCGCGCGGCACCA-3'
[0048] 從基因組DNA中PCR擴增基因：
[0049] 以C.owensensis基因組DNA為模板，引用設(shè)計引物進行PCR擴增CoXylanaseA 基因和CoXylosidaseA基因，瓊脂糖凝膠電泳檢測確認擴增DNA片段，用普通瓊脂糖凝膠 DNA回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物。
[0050] 高溫木聚糖酶CoXylosidaseA基因的酶切與連接：
[0051] 高溫木聚糖酶CoXylosidaseA基因DNA片段和質(zhì)粒pET_2