ABCBl加入10uL DHlOBac大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞
(英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司)，輕搖混勻，放入冰水浴30分鐘，置于42°C熱處理45秒，然后迅速移至冰水中放置2分鐘。
[0026]②在該管中加入滅菌的LB液體培養(yǎng)基900ul，37°C搖床220rpm振蕩培養(yǎng)I小時，
使之發(fā)生轉(zhuǎn)座。
[0027]③用②步驟所得LB培養(yǎng)液制備10倍系列的細(xì)胞稀釋液，以10、100，和1000倍不同的稀釋度稀釋，各取10PL分別涂布于含5(^g/mL卡那霉素、7Pg/mL慶大霉素、lOPg/mL四環(huán)霉素、lOOPg/mL X-gal、4(^g/mL IPTG 的 LB 平板。
[0028]④將LB平板于37°C倒置培養(yǎng)48小時，觀察藍(lán)白斑的生長情況。發(fā)生轉(zhuǎn)座后的DHlOBac細(xì)菌因其LacZ基因被插入失活，而使含有重組Bacmid的大腸桿菌菌落成為白色。未被插入的空白DHlOBac細(xì)菌則生長成為藍(lán)色菌落。
[0029](2)重組桿狀病毒穿梭載體Bacmid-hABCBl的提取:
陽性表形的確定:
①用10μ1的槍頭輕輕挑取10個分隔較大的白色菌落，劃線于同樣含有卡那霉素、慶大霉素、四環(huán)霉素、X-gal、IPTG的LB平板上，37°C培養(yǎng)過夜。
[0030]②如果所得菌落仍然均為自斑，說明所挑菌落均為真正含有整合了目的基因的陽性克隆 Bacmid-hABCBl ；
③從再劃線平板上挑取單獨的陽性白色單克隆置于含卡那霉素、慶大霉素、四環(huán)霉素的液體培養(yǎng)液中，37°C搖床220rpm振蕩培養(yǎng)24小時。
[0031]④將此培養(yǎng)液按照質(zhì)粒DNA抽提試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)的說明進(jìn)行重組桿狀病毒穿梭載體的DNA抽提。
[0032](3)重組桿狀病毒穿梭載體Bacmid-hABCBl的PCR鑒定:
分別以 T-pFast F (SEQ ID N0.1)、T-pFast R (SEQ ID N0.2) ； T-hABCBl F (SEQID N0.3)、T-hABCBl R (SEQ ID N0.4) ； T-pFast F (SEQ ID N0.1)、T-hABCBl R (SEQID N0.4)為引物組合對提取的重組質(zhì)粒DNA進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增，能夠擴(kuò)增出對應(yīng)的4372bp、460bp、875bp目標(biāo)片段的即為真正含有整合了目的基因的重組桿狀病毒穿梭載體Bacmid-hABCBlο
[0033]【實施例3】重組桿狀穿梭載體病毒Bacmid-hABCBl轉(zhuǎn)染sf9細(xì)胞 (I)轉(zhuǎn)染sf9單層細(xì)胞:
在細(xì)胞培養(yǎng)的六孔板中每孔以2mL的無血清無抗生素的昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基(英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司)接種9 X 15個SF9細(xì)胞，培養(yǎng)過夜，待細(xì)胞密度長至60%?70%時進(jìn)行轉(zhuǎn)染。在無菌的小離心管中配制以下溶液:
A液:2Pg重組Bacmid-hABCBl質(zhì)粒DNA加ΙΟΟμ?無血清無抗生素的昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基；B液:6μ?脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Cellfectin (英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司)加ΙΟΟμ?無血清無抗生素的昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基；
然后將A液和B液輕輕混合均勻，室溫放置15分鐘，同時去除六孔板中每個孔中的培養(yǎng)液，以無血清無抗生素的昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基洗滌一遍，棄凈培養(yǎng)液。在上述混合液中補加800μ?無血清無抗生素的昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基，至總體積約lmL，再加入每個孔中，置于27°C孵育。5小時后去除DNA混合液，每孔加入2mL無血清無抗生素的昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基，在27°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72小時之后觀察細(xì)胞感染病毒狀況。
[0034](2)重組桿狀病毒的獲得與擴(kuò)大:
①待被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞大部分出現(xiàn)體積明顯增大、破裂狀況后，在每個孔中收集含有重組桿狀病毒顆粒的培養(yǎng)上清液，100g離心10分鐘去除細(xì)胞和大碎片，將上清過濾除菌后避光4°c保存，此為Pl代病毒，可用于再次感染SF9單層細(xì)胞以獲取高滴度的病毒液。
[0035]②在細(xì)胞培養(yǎng)的六孔板中每孔以2mL的無血清無抗生素的昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基接種9 X 15個SF9細(xì)胞，培養(yǎng)過夜，待細(xì)胞密度長至60%?70%時進(jìn)行轉(zhuǎn)染?？字屑尤脒m量Pl病毒液，在27°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時。鏡檢細(xì)胞病變狀況，待被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞大部分出現(xiàn)體積明顯增大、破裂狀況后，收集培養(yǎng)上清液，100g離心10分鐘去除細(xì)胞和大碎片，將上清過濾除菌后避光4°C保存，此即為P2代病毒。
[0036]③在細(xì)胞培養(yǎng)錐形瓶中以50mL無血清無抗生素的昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基接種SF9細(xì)胞，27°C搖床120rpm振蕩培養(yǎng)培養(yǎng)至細(xì)胞密度達(dá)到2父106個/1^，加入適量？2代病毒液，繼續(xù)培養(yǎng)，待被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞大部分出現(xiàn)體積明顯增大、破裂狀況后，收集培養(yǎng)上清液，100g離心10分鐘去除細(xì)胞和大碎片，將上清過濾除菌后避光4°C保存，此為P3代高滴度病毒液。
[0037]【實施例4】重組hABCBI蛋白的獲得
(I)大量培養(yǎng)表達(dá)重組hABCBI的SF9細(xì)胞:
在細(xì)胞培養(yǎng)錐形瓶中以500mL無血清無抗生素的昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基接種SF9細(xì)胞，27°C搖床120rpm振蕩培養(yǎng)培養(yǎng)至細(xì)胞密度達(dá)到2X 16個/mL，加入適量P3代病毒液，培養(yǎng)48-72小時。2000g離心10分鐘去除上清，將沉淀細(xì)胞_80°C保存，此為表達(dá)重組hABCBI的SF9細(xì)胞。
[0038](2)含有重組hABCBI的細(xì)胞膜的分離提純:
①細(xì)胞破碎:
采用了氮氣減壓破碎法將SF9細(xì)胞進(jìn)行破碎。在壓力容器內(nèi)，大量的氮氣在高壓下溶解于細(xì)胞中。當(dāng)氣體壓力突然降低，細(xì)胞液內(nèi)的氮氣釋放出來的，形成氣泡，使細(xì)胞膜撐開破裂，達(dá)到破壞細(xì)胞膜，釋放細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的目的。氮氣減壓方法特別適合處理哺乳動物和其他膜結(jié)合細(xì)胞。具體的操作流程為:
a、把收集到的細(xì)胞沉淀用TBS溶液稀釋倍，置于耐高壓容器里面；
b、充入高壓氮氣(1000PSI)，冰浴靜置15分鐘，讓細(xì)胞內(nèi)外達(dá)到壓力一致；
C、通過閥門緩慢把細(xì)胞液釋放出來，收集于接收容器當(dāng)中。
[0039]②蛋白分離:
通過對上述收集的細(xì)胞破碎液進(jìn)行3次離心，即可得到高濃度、高純度的SF9細(xì)胞膜蛋白，過程簡單，蛋白無需經(jīng)過復(fù)雜的處理，蛋白的活性高。具體的操作流程為:
a:初步離心:對上述收集的細(xì)胞破碎液進(jìn)行4000g離心10分鐘，取出上清液保存，丟棄沉淀；
b:超高速蔗糖密度梯度離心:把15ml濃度34%的蔗糖溶液加入離心管，把15ml經(jīng)過初步離心的上清液加到蔗糖溶液的上面，10000g離心30分鐘，取出上清液與蔗糖中間的白色條帶部分保存；
c:將b步中的保存的溶液用TBS稀釋3倍，10000g離心30分鐘，丟棄上清液，將沉淀復(fù)溶于蛋白保存液中，即為可作為體外檢測運用的藥物轉(zhuǎn)運體蛋白膜。
[0040]【實施例5】重組hABCBl蛋白的功能驗證底物測定法:
ABCBl轉(zhuǎn)運體蛋白利用ATP作為能量，能夠與它的底物結(jié)合并實現(xiàn)跨膜轉(zhuǎn)運。利用細(xì)胞膜蛋白在特定溶液環(huán)境中能夠形成閉合的微囊泡的特性，把ABCBl蛋白的轉(zhuǎn)運底物加入表達(dá)ABCBl蛋白的細(xì)胞膜中，分別加入ATP/AMP反應(yīng)，終止反應(yīng)后把微囊泡外面的底物洗去，用液相色譜儀/質(zhì)譜儀聯(lián)用法或熒光測定法來測定微囊泡內(nèi)的底物的濃度，從而判定ABCBl蛋白的活性值。底物濃度越大，則ABCBl的活性值越高。本實例中采用液相色譜儀/質(zhì)譜儀聯(lián)用法。
[0041](I)將分離提純得到的重組hABCBl蛋白進(jìn)行蛋白濃度測定(用BCA蛋白定量法)，并根據(jù)所測濃度用蛋白保存液稀釋至5mg/mL。
[0042](2)取上述濃度的蛋白10uL，加入含有4mM ATP (或4mM AMP), 1uM Digoxin (為ABCBl的轉(zhuǎn)運底物)的反應(yīng)緩沖液40ul中開始反應(yīng)，并于O分鐘，I分鐘，5分鐘加入終止液，
終止反應(yīng)。
[0043](3)把終止后的反應(yīng)液全部轉(zhuǎn)移到96孔過濾板中，真空抽濾；用反應(yīng)終止液清洗過濾板5次。
[0044](4)分3次往過濾板中各孔加入10% SDS溶液50uL，用黑色96孔板收集全部濾液。
[0045](5)黑色96孔板中各孔加入10uL ACN (乙腈)，混勻后用液相色譜儀/質(zhì)譜儀聯(lián)用法測定Digoxin濃度。
[0046]本發(fā)明尚有多種實施方式，凡采用等同變換或者等效變換而形成的所有技術(shù)方案，均落在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項】
1.一種在昆蟲細(xì)胞Sf9中表達(dá)人hABCBl的方法，其特征在于包括如下步驟: 步驟一，人工合成兩端分別包含BamHI和HindIII酶切位點的hABCBl基因； 步驟二，將hABCBl基因克隆入pFastBacl載體的BamHI/Hindlll位點，得到重組質(zhì)粒pFastBacl-hABCBl ； 步驟三，將重組質(zhì)粒pFastBacl-hABCBl轉(zhuǎn)化DHlOBac大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，與其中的桿狀病毒穿梭載體Bacmid重組，獲得插入hABCBl基因的重組桿狀病毒穿梭載體Bacmid-hABCBl ； 步驟四，脂質(zhì)體介導(dǎo)重組桿狀病毒穿梭載體Bacmid-hABCBl轉(zhuǎn)染sf9昆蟲細(xì)胞，獲高滴度的hABCBl的重組病毒； 步驟五，hABCBl的重組病毒感染SF9昆蟲細(xì)胞，大量表達(dá)hABCBl蛋白。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種在昆蟲細(xì)胞sf9中表達(dá)hABCBl的方法，其特征在于:步驟一所述的兩端分別包含BamHI和HindIII酶切位點的人hABCBl基因通過如下方法獲得:根據(jù)NCBI參考序列信息NM_000927.4，在5 ‘端添加BamHI酶切位點序列，在3’端添加HindIII酶切位點序列，序列總長度為4056bp。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種在昆蟲細(xì)胞sf9中表達(dá)hABCBl的方法，其特征在于:還包含對所述重組桿狀病毒穿梭載體Bacmid-hABCBl的PCR鑒定方法，步驟如下:分別以T-pFast F:(SEQ ID N0.1 )和 T-pFast R: (SEQ ID N0.2)、T_hABCBl F:(SEQ ID N0.3)和T-hABCBl R: (SEQ ID N0.4)、或 \ 和 T-pFast F: (SEQ ID N0.1 )和 T-hABCBl R: (SEQ IDN0.4)為引物組合對SF9-hABCBl基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增出對應(yīng)的4372bp、460bp、875bp目標(biāo)片段，即為hABCBl基因在SF9昆蟲細(xì)胞中表達(dá)完成。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種在昆蟲細(xì)胞sf9中表達(dá)hABCBl的方法，其特征在于:還包括重組hABCBl蛋白功能的鑒定方法，步驟如下: 將ABCBl蛋白的轉(zhuǎn)運底物加入表達(dá)ABCBl蛋白的細(xì)胞膜中，加入ATP/AMP反應(yīng)，反應(yīng)終止后將細(xì)胞膜中微囊泡外的轉(zhuǎn)運底物洗去，通過液質(zhì)聯(lián)用、熒光測定法或同位素標(biāo)記底物法中的一種來測定微囊泡內(nèi)的轉(zhuǎn)運底物濃度，從而判定ABCBl蛋白的活性。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種在昆蟲細(xì)胞sf9中表達(dá)hABCBl的方法，其特征在于:所述微囊泡內(nèi)的轉(zhuǎn)運底物濃度越大，ABCBl的活性越高。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種在昆蟲細(xì)胞sf9中表達(dá)hABCBl的方法，其特征在于:所述的重組病毒培養(yǎng)基為無血清無抗生素的昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種在昆蟲細(xì)胞sf9中表達(dá)人hABCB1的方法，是將兩端分別包含BamHI和HindIII酶切位點的人ABCB1基因克隆入pFastBac1載體的BamHI和HindIII位點，將得到的重組質(zhì)粒pFastBac1-hABCB1轉(zhuǎn)化DH10Bac大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，獲得插入hABCB1基因的重組桿狀病毒穿梭載體Bacmid-hABCB1，脂質(zhì)體介導(dǎo)上述重組桿狀病毒穿梭載體Bacmid-hABCB1轉(zhuǎn)染sf9昆蟲細(xì)胞，獲得表達(dá)hABCB1的重組病毒，進(jìn)一步培養(yǎng)所述重組病毒，表達(dá)hABCB1蛋白。本發(fā)明方法為hABCB1蛋白的大量獲得提供一條新途徑，為hABCB1蛋白的應(yīng)用開發(fā)打下工作基礎(chǔ)。
【IPC分類】C12N15-866
【公開號】CN104745631
【申請?zhí)枴緾N201310749571
【發(fā)明人】謝偉勝, 張科之
【申請人】蘇州杰諾曼博生物科技有限公司
【公開日】2015年7月1日
【申請日】2013年12月31日