尼帕病毒和豬流感病毒的二重熒光rt-pcr檢測試劑及其制備方法與用圖
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術領域，具體涉及一種尼帕病毒和豬流感病毒的二重熒光 RT-PCR檢測試劑及其制備方法與用途。
【背景技術】
[0002] 尼帕病毒是一種嚴重危害人和豬只健康的人畜共患病一尼帕病的病原體，臨床表 現(xiàn)以神經(jīng)系統(tǒng)和呼吸系統(tǒng)疾病為特征，不同年齡的豬臨床癥狀也有所不同。人主要通過創(chuàng) 口與感染豬的分泌物、排泄物直接接觸而感染，也可通過空氣而感染，導致發(fā)病死亡。因此， 尼帕病毒感染豬是人的尼帕病的重要傳染源。豬流感是由A型流感病毒引起豬或人的一種 急性、人畜共患呼吸道傳染病。由于豬的尼帕病和豬流感在臨床表現(xiàn)上相似，僅憑臨床癥狀 不易區(qū)分，因此對臨床疑似發(fā)病豬的尼帕病毒和豬流感病毒的鑒別檢測，對于及早發(fā)現(xiàn)和 控制這兩種動物疫病，進而防止人的尼帕病和流感的發(fā)生及流行具有重要的應用價值。多 重熒光RT-PCR方法可同時檢測多種病原核酸，具有一次RT-PCR反應就能簡便、快速地鑒別 和檢測多種病原的優(yōu)點，能夠同時滿足多種疾病診斷的要求。目前檢測單一尼帕病毒和豬 流感病毒的熒光RT-PCR方法和公開專利均有報道，而能夠同時檢測尼帕病毒和豬流感病 毒的二重熒光定量RT-PCR檢測試劑及其制備方法與應用，還罕見報道。

【發(fā)明內容】

[0003] 本發(fā)明所要解決的技術問題是，提供一種尼帕病毒和豬流感病毒的二重熒光 RT-PCR檢測試劑及其制備方法與用途，具體涉及一種分別以尼帕病毒M基因和豬流感病毒 M基因為擴增靶序列而研制的檢測試劑，該檢測試劑包括二對引物、二條標記探針和二個陽 性對照。
[0004] 為了解決上述技術問題，本發(fā)明采用的技術方案是通過以下步驟實現(xiàn)的：一種尼 帕病毒和豬流感病毒的二重熒光RT-PCR檢測試劑，包括用于分別檢測尼帕病毒M基因和豬 流感病毒M基因的二對特異性引物、二條特異性探針和二個陽性對照，擴增目標長度分別 為79bp和80bp，引物和探針序列為：
[0005] 尼帕病毒：
[0006] 上游引物：NIPHA-M-F:5'-GCTCAACAGATTGACCTGGAAC-3' SEQ ID NO. 1
[0007] 下游引物：NIPHA-M-R :5'-AACAGAAGGCTGCAACACAGC-3' SEQ ID NO. 2
[0008] 探針：NIPHA-M-P:5' -FAM-CTCGGCTGATCTCACA-3' -MGB SEQ ID NO. 3
[0009] 陽性對照：NIPHA-M: GATGGACATCAATCCTTGGCTCAACAGATTGACCTGGAACAACAGTTGTGAG ATCAGCCGAGTAGCAGCTGTGTTGCAGCCTTCTGTTCCAAGAGAGTTCATGATCTATGATGATGTCTTCATTGACAA TACAGGGAG SEQ ID NO. 4
[0010] 豬流感病毒：
[0011] 上游引物：Siv-M-F:5'-CGGTCTCACAGACAGATGGCTAC-3' SEQ ID NO. 9
[0012] 下游引物：SIV-M-R :5' -GTGCTAGCCAACACCATTCTG-3' SEQ ID NO. 10
[0013] 探針：SIV-M-P:5' -VIC-ACCACCAATCCACTAATCAGGCA-3'-MGB SEQ ID NO. 11
[0014] 豬流感病毒 M 基因陽性對照序列：CTGAITCACAGCATCGGTCTCACAGACAGATGGCTACTAC CACCAATCCACTAATCAGGCATGAGAACAGAATGGTGTTGGCTAGCACTACGGCA SEQ ID NO. 12。
[0015] 上述的尼帕病毒和豬流感病毒的二重熒光RT-PCR檢測試劑的制備方法，包括以 下步驟：
[0016] (1)選擇尼帕病毒M基因序列保守片段為擴增和制備陽性對照的靶目標序列，其 核苷酸序列如SEQ ID N0. 4所示，為：
[0017] GATGGACATCAATCCTTGGCTCAACAGATTGACCTGGAACAACAGTTGTGAGATCAGCCGAGTAGCAGC TGTGTTGCAGCCTTCTGTTCCAAGAGAGTTCATGATCTATGATGATGTCTTCATTGACAATACAGGGAG ；
[0018] (2)選擇豬流感病毒M基因序列保守片段為擴增和制備陽性對照的靶目標序列， 其核苷酸序列如SEQ ID N0. 12所示，為：
[0019] CTGATTCACAGCATCGGTCTCACAGACAGATGGCTACTACCACCAATCCACTAATCAGGCATGAGAACA GAATGGTGTTGGCTAGCACTACGGCA ；
[0020] (3)設計4條引物，以之PCR擴增和制備尼帕病毒M基因陽性對照，引物序列SEQ ID NO. 5-SEQ ID N0. 8 如下：
[0021] NIPHA-F1:5 ' -CCTGGAACAACAGTTGTGAGATCAGCCGAGTAGCAGCTGTGTTGCAGCCTTCTGTT CC-3'
[0022] NIPHA-R1:5 ' -GGAACAGAAGGCTGCAACACAGCTGCTACTCGGCTGATCTCACAACTGTTGTTCCA GG-3 ,
[0023] NIPHA-F2:5 ' -GATGGACATCAATCCTTGGCTCAACAGATTGACCTGGAACAACAGTTGTGAGA TC-3'
[0024] NIPHA-R2:5 ' -GAAGACATCATCATAGATCATGAACTCTCTTGGAACAGAAGGCTGCAACACAGC TG-3 ,
[0025] (4)設計4條引物，以之PCR擴增和制備豬流感病毒M基因陽性對照，引物序列SEQ ID NO. 13-SEQ ID NO. 16,如下：
[0026] SM-M-Fl: 5，-CTGATTCACAGCATCGGTCTCACAGACAGATGGCTACTA-3 '
[0027] SM-M-Rl: 5 ' -TGCCGTAGTGCTAGCCAACACCATTCTGTTCTCATGCCTG-3 '
[0028] SIV-M-F2:5 ' -CACAGACAGATGGCTACTACCACCAATCCACTAATCAGGCATGAGAACAGAATG GT-3'
[0029] SIM-M-R2:5 ' -ACCATTCTGTTCTCATGCCTGATTAGTGGATTGGTGGTAGTAGCCATCTGTCTG TG-3 ,
[0030] (5)分別根據(jù)尼帕病毒M基因陽性對照序列和豬流感病毒M基因陽性對照序列設 計多對引物和多條探針，經(jīng)過大量的對比篩選試驗，確定最適的引物對和標記探針組合：
[0031] 尼帕病毒：
[0032] 上游引物：NIPHA-M-F:5'-GCTCAACAGATTGACCTGGAAC-3' SEQ ID NO. 1
[0033] 下游引物：NIPHA-M-R :5'-AACAGAAGGCTGCAACACAGC-3' SEQ ID NO. 2
[0034] 探針：NIPHA-M-P:5' -FAM-CTCGGCTGATCTCACA-3' -MGB SEQ ID NO. 3
[0035] 豬流感病毒：
[0036] 上游引物：SIV-M-F:5' -CGGTCTCACAGACAGATGGCTAC-3' SEQ ID NO. 9
[0037] 下游引物：SIV-M-R :5'-GTGCTAGCCAACACCATTCTG-3' SEQ ID NO. 10
[0038] 探針：SIV-M-P: 5 ' -VIC-ACCACCAATCCACTAATCAGGCA-3 ' -MGB SEQ ID NO. 11
[0039] (6)檢測尼帕病毒M基因的探針的5'端標記的熒光報告基團是FAM，3'端標記的 非熒光淬滅基團為MGB ;檢測豬流感病毒M基因的探針的5'端標記的熒光報告基團是VIC， 3'端標記的非熒光淬滅基團為MGB ;
[0040] (7)經(jīng)過大量的對比試驗和反應條件優(yōu)選，確定二重熒光RT-PCR最適的反應條 件、引物及探針的特異性和靈敏度。
[0041] 所述（5)中的最適的反應條件為檢測尼帕病毒M基因和豬流感病毒M基因的上、 下游引物使用濃度均為15pmol/ y L，探針的使用濃度均為5pmol/ y L，在25 y L體系中均加 入0. 5 y L的引物及探針，引物及探針的特異性使其區(qū)別于豬源其它病毒，檢測尼帕病毒M 基因和豬流感病毒M基因的靈敏度分別達到46個拷貝~58個拷貝。
[0042] 所述的尼帕病毒和豬流感病毒的二重熒光RT-PCR檢測試劑在生產標準化試劑盒 中的應用。
[0043] 所述的尼帕病毒和豬流感病毒的二重熒光RT-PCR檢測試劑在繪制尼帕病毒和豬 流感病毒熒光定量PCR檢測標準曲線的用途。
[0044] 本發(fā)明的有益效果是：⑴具有特異、敏感、準確、快速的特點，可用于同時檢測家 豬及其相關樣本中的微量尼帕病毒和豬流感病毒核酸。（2)本發(fā)明中的尼帕病毒M基因 和豬流感病毒M基因對照制備方法，既不涉及尼帕病毒和豬流感病毒及其基因組核酸的使 用，也不需要人工合成較長的尼帕病毒M基因RNA片段和豬流感病毒M基因RNA片段，具有 簡便、安全和經(jīng)濟的優(yōu)勢。
【附圖說明】
[0045] 圖1為最適引物對與標記探針對尼帕病毒M基因陽性對照的熒光RT-PCR擴增曲 線。
[0046] 圖2為最適引物對與標記探針對尼帕病毒M基因陽性對照的熒光特異性擴增曲 線。
[0047] 圖3為對4. 6X107~4. 6X10 kopies/yL濃度范圍內的尼帕病毒M基因陽性對 照的熒光定量RT-PCR擴增動力學曲線。
[0048] 圖4為尼帕病毒M基因的熒光定量RT-PCR標準曲線。
[0049] 圖5為最適引物對與標記探針對豬流感病毒M基因陽性對照的熒光RT-PCR擴增 曲線。
[0050] 圖6為最適引物對與標記探針對豬流感病毒M基因的熒光RT-PCR特異性擴增曲 線。
[0051] 圖7為對5. 8 X 107~5. 8 X 10 kopies/ y L濃度范圍內的豬流感病毒M基因陽性 對照的熒光定量RT-PCR擴增動力學曲線。
[0052] 圖8為豬流感病毒M基因的熒光定量RT-PCR標準曲線。
【具體實施方式】
[0053] 下面結合附圖和【具體實施方式】對本發(fā)明做進一步詳細描述。
[0054] 本發(fā)明的尼帕病毒和豬瘟病毒的二重熒光RT-PCR檢測試劑及其制備方法與用 途，包括以下步驟。
[0055] 第一步驟是制備尼帕病毒M基因的陽性對照物質（RNA)，過程包括：
[0056] (1)在NCBI網(wǎng)站中，對尼帕病毒M基因序列進行BLAST比對，選擇一段保守序列用 于尼帕病毒M基因陽性對照制備，如SEQ ID N0. 4所示。
[0057] (2)